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產(chǎn)品名稱 | 檢測方法 | 規(guī)格 | 貨號 |
葉綠體復(fù)合體Ⅱ試劑盒 | 分光光度法 | 25管/24樣 | CS-01S63319 |
復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同時輔基FAD還原為FADH2,后者進一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q,是呼吸電子傳遞鏈的支路。
測定原理
復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進一步還原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰,通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計算該酶活性。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制
試劑一:50mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:液體25mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑五:液體2.5mL×1瓶,4℃保存;
葉綠體的提?。?/span>
1、稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一,用冰浴勻漿器或研缽勻漿,很快研磨或搗碎,30秒內(nèi)完成,使之成為勻漿液。
2、將勻漿液于200g(離心率),4℃離心1min。
3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,1500g,4℃離心5min。
棄上清液,于沉淀中加入0.5mL試劑一混勻配成葉綠體懸浮液。混勻后測定葉綠體酶活性測定步驟:
1、分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至605nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
(1)工作液的配制:臨用前把試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑二中混合溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
(2)在1mL玻璃比色皿中加入40μL樣本、100μL試劑五和800μL工作液,立即混勻,記錄605nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。
復(fù)合體Ⅱ活力單位的計算
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=280×ΔA÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =0.560×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,9.4×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.04 mL;V樣總:加入提取液體積,0.5 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500萬。
原創(chuàng)作者:上海莼試生物技術(shù)有限公司
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