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產(chǎn)品名稱 | 檢測方法 | 規(guī)格 | 貨號 |
胃蛋白酶(Pepsin)試劑盒 | 分光光度法 | 50管/24樣 | CS-01S63226 |
測定原理:
胃蛋白酶可催化血紅蛋白水解,水解產(chǎn)物與福林試劑反應(yīng)后顯藍色;一定范圍內(nèi),其顏色的深淺與胃蛋白酶活性呈正比。
自備儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體50mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體50mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入25 mL試劑二充分溶解。
試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入25 mL蒸餾水充分溶解。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入30 mL蒸餾水充分溶解。
試劑六:液體5mL×1瓶,4℃保存。
標準品:液體1.26mL×1支,0.5 μ mol/mL酪氨酸標準溶液濃度4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即粗酶液。
測定步驟:
1.分光光度計預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到580 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三和試劑四置于37℃水浴預(yù)熱30min。
3. 標準管:取玻璃比色皿,加入100μL標準品,200μL試劑二,600μL試劑五,100μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于580 nm測光吸收,記為A標準管。
4. 空白管:取玻璃比色皿,加入100μL蒸餾水,200μL試劑二,600μL試劑五,100μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于580 nm測光吸收,記為A空白管。
5. 對照管:取EP管,加入500 μL蒸餾水,置于37℃水浴保溫10min;加入500μL試劑四,蓋緊后搖勻1min;加入100μL粗酶液,混勻后8000g 4℃離心10分鐘取上清;在玻璃比色皿中加入上清液100μL,再加入200μL試劑二,600μL試劑五,100μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于580 nm測光吸收,記為A對照管。
6. 測定管:取EP管,加入100μL粗酶液,500 μL試劑三,置于37℃水浴保溫10min;加入500μL試劑四,蓋緊后搖勻1min;8000g 4℃離心10分鐘取上清;在玻璃比色皿中加入上清液100μL,再加入200μL試劑二,600μL試劑五,100μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于580 nm測光吸收,記為A測定管。
注意:空白管和標準管只需要測定一次。
計算公式:
(1) 按照蛋白濃度計算
活性單位定義:37℃每毫克蛋白每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個酶活單位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/mg prot)=C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×稀釋倍數(shù)÷(Cpr×V1)÷T=5500×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷Cpr
C標準品:標準品濃度,0.5 μ mol/mL酪氨酸;稀釋倍數(shù):(100+500+500)÷100=11;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測定;V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),100μL=0.1 mL;T:催化反應(yīng)時間(min),10min。
(2)按照樣本質(zhì)量計算
活性單位定義:37℃每克組織每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個酶活單位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/g鮮重)=C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×稀釋倍數(shù)÷(W×V1÷V2)÷T=5500×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W
C標準品:標準品濃度,0.5 μ mol/mL酪氨酸;稀釋倍數(shù):(100+500+500)÷100=11;W:組織質(zhì)量(g);V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),100μL= 0.1 mL;V2:粗酶液總體積(mL),1mL;T:催化反應(yīng)時間(min),10min。
注意事項
試劑三、試劑四、試劑五臨用前配制,配制好用不完的試劑4℃可保存一周。
原創(chuàng)作者:上海莼試生物技術(shù)有限公司
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