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標簽:線粒體復合體Ⅳ試劑盒
聯(lián)系人:高小姐
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| 產(chǎn)品名稱 | 檢測方法 | 規(guī)格 | 貨號 |
| 線粒體復合體Ⅳ試劑盒 | 分光光度法 | 25管/24樣 | CS-01Ｓ63323 |
線粒體復合體Ⅳ又稱細胞色素C氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負責催化還原型細胞色素C的氧化，并最終把電子傳遞給氧，生成水。
測定原理：
還原型細胞色素C在550nm有特征光吸收，線粒體復合體Ⅳ催化還原型細胞色素C生成氧化型細胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復合體Ⅳ酶活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：25mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二： 5mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：0.5 mL×1瓶，-20℃保存；
試劑四：液體10mL×2瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×2支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×2支，-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、準確稱取0.1g組織或收集500萬細菌或細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿600g，4℃離心5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅳ（此步可選做）。
5、步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復30次），用于復合體Ⅳ酶活性測定。
測定步驟：
1、分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
（1）工作液的配制：臨用前取試劑四、試劑五、試劑六各一支，將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
（2）將工作液置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min；
（3）在1mL玻璃比色皿中加入80μL樣本和800μL工作液，混勻，記錄550nm處初始吸光值A1和 37℃反應30min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。
注意點：
1、若ΔA大于0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當倍數(shù)（計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)），使A1-A2小于0.2，可提高檢測靈敏度。
2、動物肝臟樣本由于酶活性過高， 1分鐘內(nèi)吸光值就會到達平臺期，務必先進行2個樣本的預測定?？蓪颖居迷噭┒♂?/span>10~50倍，反應時間縮到到30秒或1分鐘（計算公式中代入實際反應時間，并乘以相應稀釋倍數(shù)）。其他樣本可按照正常測定步驟進行。
復合體Ⅳ活力單位的計算：
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3.88×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.008×ΔA
V反總：反應體系總體積，8.8×10-4 L；ε：細胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.08 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。
原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司
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