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ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細胞、動物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物ME活性測定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點。根據(jù)輔酶專一性和對底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

商品介紹：

測定原理：

NAD-ME催化NAD+還原成NADH，在340nm下測定NADH增加速率。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存。；

試劑一：液體40mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1支，4℃保存；用時加2mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；用時加1mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣本的前處理：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一、二、三和四置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。如果一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻，立即記錄 340 nm波長下初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

注意：如果ΔA＜0.005，可將反應(yīng)時間延長到2分鐘或5分鐘。

NAD-ME活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T= 4823×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T = 4823×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =9.646×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，9×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

注意：

1. 本產(chǎn)品僅供科研使用。請勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區(qū)。
2. 為了您的安全和健康，請穿好實驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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NAD-蘋果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）試劑盒分光光度法50管/48樣

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