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產(chǎn)品名稱	檢測方法	規(guī)格	貨號
果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase，PFK）試劑盒	分光光度法	50管/48樣	CS-01Ｓ63448

注意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

PFK（EC 2.7.1.11）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，負責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖-1,6二磷酸和ADP，是糖酵解過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

商品介紹：

測定原理

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PFK活性。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體40mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存，臨用前加入2.8mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1支，4℃保存，臨用前加入260μL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：液體16μL×1支，4℃保存，臨用前加入260μL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融；

樣本的前處理

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟和加樣表

1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液（可測25個樣）的配制：取19mL試劑一和1.26mL試劑二充分混勻；用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融；

3、將工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘。

4、加樣表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，立即混勻，加試劑四的同時開始計時，記錄在340 nm波長下20秒時的初始吸光度A1和10分20秒時的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：不同勻漿組織中PFK活力不一樣，做正式試驗之前請做1-2只預(yù)試，若ΔA>0.5，則說明活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），或縮短反應(yīng)時間至2min或5min，使ΔA<0.5，以提高檢測靈敏度。

PFK活力單位的計算

1、血清（漿）PFK活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=450×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PFK活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=450×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總)÷T=0.225×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數(shù)，2000萬。

注意：

1. 本產(chǎn)品僅供科研使用。請勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區(qū)。
2. 為了您的安全和健康，請穿好實驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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