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線粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產生的質子電化學梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關鍵酶。

商品介紹：

測定原理

復合體Ⅴ水解ATP產生ADP和Pi，通過測定Pi增加速率來測定復合體Ⅴ活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：25mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：25mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：1 mL×1瓶，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前每支加入1.3mL蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五：6mL×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑九：液體10mL×1 瓶，室溫保存。

定磷試劑的配制：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少）。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①準確稱取0.1g組織或收集500萬細菌或細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②將勻漿600g，4℃離心5min。

③棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅴ（此步可選做）。

⑤步驟④中的沉淀即為線粒體，加入800uL試劑二和8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復30次），用于復合體Ⅴ酶活性測定。

測定步驟

1、酶促反應

復合體Ⅴ活性計算

標準條件下測定的回歸方程為y = 1.274x + 0.004；x為標準品濃度（mmol/L），y為A值。

1、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T

=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)

V反總：反應體系總體積，3×10-4 L； V樣：加入樣本體積，0.125 mL；V樣總：加入提取液體積，0.808 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

注意：

1. 本產品僅供科研使用。請勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區(qū)。
2. 為了您的安全和健康，請穿好實驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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線粒體復合體Ⅴ試劑盒分光光度法25管/12樣

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