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標(biāo)簽:輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒
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人增殖誘導(dǎo)配體酶聯(lián)免疫試劑盒實(shí)驗(yàn)技術(shù)
小鼠細(xì)胞色素C（Cyt-C）ELISA試劑盒注意事項(xiàng)
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公司上萬種科研產(chǎn)品，主要供應(yīng)各大科研單位和學(xué)校，是國內(nèi)眾多科研單位的供應(yīng)商。公司嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，確保每一個(gè)出廠產(chǎn)品質(zhì)量合格，讓您買的省心，用得放心。
| 產(chǎn)品名稱 | 檢測方法 | 規(guī)格 | 貨號(hào) |
| 輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒 | 微量法 | 100管/48樣 | CS-01Ｓ63725 |
注意：正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時(shí)，形成大量的ROS，同時(shí)NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和TCA循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+比值升高也可
測定原理
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測吸光值；而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進(jìn)一步采用MTT還原法檢測。
需自備的儀器和用品
酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
酸性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；
堿性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體3 mL×1瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1瓶，-20 ℃保存，用時(shí)加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周；
試劑四：粉劑×1瓶，4 ℃保存，用時(shí)加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周；
試劑五：液體3.6mL×1瓶，4 ℃保存；
試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存；
試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。
NAD+和NADH的提取
1 血清（漿）中NAD+和NADH的提取
NAD+的提。喊凑昭澹{）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。
NADH的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL堿性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2組織中NAD+和NADH的提。
NAD+的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。
NADH的提。喊凑战M織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。
3 細(xì)胞或細(xì)菌中NAD+和NADH的提。
NAD+的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g?4?℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。
NADH的提。合仁占(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：堿性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g?4?℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。
2、加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）：
注意事項(xiàng)
1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。
2、對(duì)照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對(duì)照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。
3、反應(yīng)過程中注意避光。
4、若NAD+測定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH測定中△A（A2-A1）≤0.0222，說明樣本中輔酶含量較低，已低于檢測限，可做如下調(diào)整：（1）將測定管避光靜置時(shí)間20min延長到60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取0.2g樣本或0.2mL樣本加入1mL提取液。
5、由于每一個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，本試劑盒100管保證測48個(gè)NAD+或NADH.
NAD+和NADH含量的計(jì)算
（一）NAD+含量的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.1475x + 0.0302，R2 = 0.9978；其中y為△A，x為NAD+濃度nmol/mL
1、血清（漿）中NAD+含量計(jì)算
NAD+含量(nmol/mL）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302）
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD+含量計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
NAD+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302）÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
NAD+ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302）÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
NAD+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302）
（二）NADH含量的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.1404x + 0.0222，R2 = 0.9976；其中y為△A，x為NADH濃度nmol/mL
1、血清（漿）中NADH含量計(jì)算
NADH含量(nmol/mL）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222）
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADH含量計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222）÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
NADH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222）÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222）
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
注意：最低檢測限為0.1nmol/mL或0.1nmol/g鮮重 或0.001nmol/mg prot
1. 本產(chǎn)品僅供科研使用。請(qǐng)勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請(qǐng)勿存放于普通住宅區(qū)。
2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿好實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套和口罩操作。
原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司
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