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標(biāo)簽:γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）
聯(lián)系人:高小姐
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詳細(xì)地址：上海嘉定區(qū)嘉羅公路1661
公司上萬種科研產(chǎn)品，主要供應(yīng)各大科研單位和學(xué)校，是國內(nèi)眾多科研單位的供應(yīng)商。公司嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，確保每一個出廠產(chǎn)品質(zhì)量合格，讓您買的省心，用得放心。
| 產(chǎn)品名稱 | 檢測方法 | 規(guī)格 | 貨號 |
| 圖 | 微量法 | 100T/96S | CS-01Ｓ63604 |
GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。
測定原理：
在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時ATP去磷酸化產(chǎn)生無機(jī)磷分子，通過測定無機(jī)磷增加速率，即可計算出GCL活性。
自備儀器和用品：
冷凍離心機(jī)、水浴鍋、移液器、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、濃硫酸和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體105mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加6 mL蒸餾水充分震蕩溶解。
試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入蒸餾水1.5 mL充分震蕩溶解。
試劑四：液體7mL×1瓶，室溫保存。
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入12 mL蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入400μL濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。
粗酶液提?。?/span>
1.組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2.細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
3.血清等液體：直接測定。
GCL測定操作：
1.分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到660nm，蒸餾水調(diào)零。
2.空白管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一48μL、試劑二52μL、試劑三12μL和蒸餾水24μL，混勻后蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min；再加入試劑四60μL，混勻后，室溫（25℃左右）8000g，離心10 min，取上清100μL，加入試劑五100μL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660nm處光吸收，記為A空白管。
3.測定管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一48μL、試劑二52μL、試劑三12μL和上清液24μL，混勻后蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min；再加入試劑四60μL，混勻后，室溫（25℃左右）8000g，離心10 min，取上清100μL，加入試劑五100μL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660nm處光吸收，記為A測定管。
注意：空白管只需要測定一次。
GCL活性計算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.1427x，R2=0.9987
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機(jī)磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /mg prot）=[（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T
=3.815×（A測定管-A空白管）÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機(jī)磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。
GCL（μg/min /g 鮮重）= [（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 3.815×（A測定管-A空白管）÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計算
活性單位定義：37℃下，每104個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機(jī)磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /104 cell）=[（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 3.815×（A測定管-A空白管）÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按照液體體積計算
活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機(jī)磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /mL）= [（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷V樣÷T
= 3.815×（A測定管-A空白管）
0.1427：回歸方程系數(shù)；V反總：反應(yīng)總體積（mL）196 μL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，24μL =2.4×10-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間：15min。
b. 使用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.07135x，R2=0.9987
（(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機(jī)磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /mg prot）= [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T
=7.63×（A測定管-A空白管）÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機(jī)磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。
GCL（μg/min /g 鮮重）= [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 7.63×（A測定管-A空白管）÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計算
活性單位定義：37℃下，每104個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機(jī)磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /104 cell）=[（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 7.63×（A測定管-A空白管）÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按照液體體積計算
活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機(jī)磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /mL）= [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷V樣÷T
=7.63×（A測定管-A空白管）
0.07135：回歸方程系數(shù)；V反總：反應(yīng)總體積（mL）196 μL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，24μL =2.4×10-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間：15min。
注意事項：
（1）樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復(fù)凍融。
（2）所有試劑配制完后，除表明4℃保存外，請于1天內(nèi)用完。
（3）實驗過程請帶手套，試劑三中有強(qiáng)腐蝕性物質(zhì)，注意不要濺到皮膚上或眼睛內(nèi)。
（4）測定吸光值時請于水浴后10～40分鐘內(nèi)測完。
（5）樣本測定前先取1-2個樣做預(yù)實驗，如吸光值太高，應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，使得吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，哺乳動物組織和血液一般稀釋3～5倍。
（6）試劑三配制過程中，可能會產(chǎn)生黑色固體，其不影響結(jié)果，注意吸取時不要將黑色固體吸入。
（7）細(xì)胞中GCL活性測定時，細(xì)胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細(xì)胞中GCL的提取時可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞；
1. 本產(chǎn)品僅供科研使用。請勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區(qū)。
2. 為了您的安全和健康，請穿好實驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。
原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司
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3、進(jìn)口原裝產(chǎn)品要3-6周的貨期，詳細(xì)情況請咨詢客服。
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