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強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物；紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。該方法測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)，適用于蛋白質(zhì)濃度高的樣品，尤其是動物材料。

自備儀器和用品：

離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1瓶，5 mg/mL，4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取：

1.液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測定。

2.組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水））

冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即待測液。（動物樣品常常需要稀釋）

3.細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取0.5mL EP管，加入40μL蒸餾水，200μL試劑一，混勻后室溫靜置15 min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，540nm比色，記為A空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5mL EP管，加入40μL標(biāo)準(zhǔn)液，200μL試劑一，混勻后室溫靜置15 min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，540 nm比色，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測定管：取0.5mL EP管，加入40μL待測液，200μL試劑一，混勻后室溫靜置15 min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，540nm比色，記為A測定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。

樣品中蛋白質(zhì)濃度計算公式：

C待測（mg/mL）= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

=5×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

注意事項：

1.樣品蛋白濃度須在1～10mg/ml范圍內(nèi)，低于1mg/ml不能用此法，高于10mg/ml須做相應(yīng)稀釋。因此測定前用1～2個樣做預(yù)實(shí)驗，確保蛋白濃度在1～10mg/ml范圍內(nèi)。

2.待測樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的PBS提取。該法受硫酸銨、Tris緩沖液干擾，提取液中應(yīng)不含這些物質(zhì)；否則改用BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

注意：

1. 本產(chǎn)品僅供科研使用。請勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區(qū)。
2. 為了您的安全和健康，請穿好實(shí)驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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