產(chǎn)品目錄

本產(chǎn)品是一種使用特別便捷的專門用于多重PCR擴(kuò)增的2倍濃度的PCR預(yù)混液，并且PCR結(jié)束后可以直接上樣電泳無需添加上樣緩沖液。本產(chǎn)品含有BalbMulti DNA polymerase，可以高效、高特異性和高靈敏度的適用于對多個(可以過20個)目標(biāo)DNA片段同時進(jìn)行非常均衡的PCR擴(kuò)增。并且本產(chǎn)品不僅可以用于普通的多重PCR，更可以用于全血、血清或植物樣品的直接PCR，便于直接用于血液樣品中細(xì)菌和病毒感染、基因突變等的多重PCR檢測，或者用于植物樣品的基因突變、微生物感染等的多重PCR檢測。

多重PCR是一種通過單個PCR反應(yīng)同時對至少兩個或多個DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增的PCR技術(shù)。目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究、疾病診斷和法庭或診斷性的基因分型(Genotyping)等多個領(lǐng)域。該技術(shù)還可以被用于以cDNA為模板的基因定量或半定量的表達(dá)分析，其特別適合于各種動植物、真菌、細(xì)菌或病毒等微量樣品進(jìn)行多基因檢測，具備高特異性和高靈敏度的突出優(yōu)點。

產(chǎn)品特點：

本產(chǎn)品多重擴(kuò)增性能優(yōu)越。

本產(chǎn)品實測可以輕松實現(xiàn)15個目標(biāo)DNA片段的同時并且非常均衡的高效、高特異性和高靈敏度擴(kuò)增(參考圖1)。對于低至1pg的模板量，也可以通過僅30個PCR循環(huán)而被很好地擴(kuò)增(參考圖1)。普通的PCR試劑盒會由于PCR擴(kuò)增時引物和模板的偏好性，對于不同的引物和不同的模板會產(chǎn)生不同的擴(kuò)增效率，導(dǎo)致部分片段容易被擴(kuò)增，而部分片段較難被擴(kuò)增。本試劑盒使用了通過精心篩選和突變優(yōu)化的非常適合用于多重PCR的DNA聚合酶BalbMulti DNA polymerase和反復(fù)優(yōu)化的配套緩沖液，確?？梢詫崿F(xiàn)多個目標(biāo)DNA片段的高效、高特異性和高靈敏度的均衡擴(kuò)增。
保存：-20℃

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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