產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
血液直接擴(kuò)增PCR Mix	2×LoadEasy Blood Direct PCR MasterMix	20μL×100T\|20μL×500T	CS-01F97524

介紹

本制品是一種使用特別便捷的專門用于血液樣品2倍濃度的PCR預(yù)混液，并且PCR結(jié)束后可以直接上樣電泳無需添加上樣緩沖液。本產(chǎn)品含有耐血的BloodTaq DNA聚合酶，這是一種經(jīng)過基因工程改造的非常高效的適用于EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝血樣品或干血斑樣品直接PCR檢測的耐熱DNA聚合酶。

產(chǎn)品用途：

抗凝血樣品基因組DNA中目的基因的直接擴(kuò)增、基因分型(如基因缺失等)、血液樣品中細(xì)菌、病毒等微生物感染的基因檢測，以及基因敲除或轉(zhuǎn)基因小鼠基因型分析。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

對于全血樣品可以直接PCR檢測，無須提取DNA。

本產(chǎn)品對人、小鼠等全血中血紅素等各種PCR抑制劑表現(xiàn)出的抗性，對于新鮮采集的、4℃保存或低溫凍存EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝的人或小鼠血液樣品或者干血斑(如whatman903或FTA采血卡上的干血斑)，都無需進(jìn)行DNA提取純化，可以直接用于PCR擴(kuò)增目的DNA。

所需血樣少，耐血能力高。

本產(chǎn)品用于20μL的PCR擴(kuò)增體系時，通常僅加入約1μL抗凝全血即可順利完成PCR檢測。用于檢測細(xì)菌、病毒等微生物感染時，為獲得高的檢測靈敏度，20μL的PCR擴(kuò)增體系中大加入的血液量可以達(dá)到4μL，即20%體積，有些類型的抗凝血(例如人肝素抗凝血)大加入的全血體積可以達(dá)到10μL，即50%體積。

兼容EDTA、肝素或檸檬酸鈉三種常見抗凝血。

血液樣品用于PCR檢測時，EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝血都可以兼容的。如果希望取得佳的檢測效果，優(yōu)先推薦EDTA抗凝血。因為EDTA可以螯合多種核酸酶發(fā)揮酶活性所必須的金屬離子，從而可以更好地抑制核酸的降解。

本產(chǎn)品提供了一對陽性對照引物，便于確認(rèn)PCR檢測效果。

該對引物是一種哺乳動物的通用引物，可以擴(kuò)增SOX21基因上游非編碼區(qū)約237bp DNA片段，也可用于大多數(shù)脊椎動物。
保存：-20℃，適當(dāng)避免反復(fù)凍融。

實(shí)驗步驟：

(1)實(shí)驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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