產(chǎn)品目錄

本產(chǎn)品是一種使用了高保真、擴(kuò)增速度可以達(dá)到15秒/kb的BalbFusion DNA Polymerase的高保真PCR擴(kuò)增用的2×預(yù)混液。本產(chǎn)品中含有2×BalbFusion DNA Polymerase，2×BalbFusion Buffer (with Mg2+)，2×dNTPs，只需加入適量引物、模板和水即可進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。大大簡化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過程中可能導(dǎo)致的污染，使PCR的重復(fù)性更好。

利用2×BalbFusion PCR MasterMix可以進(jìn)行各種常規(guī)的PCR擴(kuò)增，特別適合用于高保真和快速的定性和半定量的PCR擴(kuò)增，以及長片段DNA(長度長可以過12kb的)的基因擴(kuò)增和克隆。

擴(kuò)增速度極快，擴(kuò)增小于6kb的DNA片段時(shí)，延伸1kb只需要15秒。普通的DNA聚合酶延伸1kb通常需要1～2分鐘。BalbFusion DNA polymerase由于其快的擴(kuò)增速度，可以顯著縮短PCR擴(kuò)增所需的時(shí)間。

BalbFusion DNA Polymerase是一種高保真DNA聚合酶，不僅可以非常高效地催化5’至3’方向的依賴于DNA模板的脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)，它同時(shí)還具有3’至5’的外切酶活性(proofreading activity)，它的錯(cuò)誤發(fā)生概率比Taq酶要低52倍，比pfu酶要約低6倍。

BalbFusion DNA Polymerase的擴(kuò)增長度長，可以達(dá)到12kb。BalbFusion DNA Polymerase非常適合長片段DNA的擴(kuò)增，擴(kuò)增出來的片段可以輕松達(dá)到12kb，更長片段的擴(kuò)增效果未經(jīng)測試。BalbFusion DNA聚合酶可以輕松勝任具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的、非常長的DNA片段的準(zhǔn)確擴(kuò)增，因此它是目的基因擴(kuò)增和克隆的理想選擇。

保存：-20℃，至少一年有效。適當(dāng)避免反復(fù)凍融。如需頻繁使用，可取適量存放于4℃，至少3天內(nèi)有效。

注意事項(xiàng)：

由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴(kuò)增目的基因序列過1000萬倍，在使用BalbFusion酶時(shí)請注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。

盡管本產(chǎn)品經(jīng)過15次反復(fù)凍融后仍具有和凍融前幾乎相同的PCR擴(kuò)增效果，但仍宜適當(dāng)避免反復(fù)凍融本產(chǎn)品，多次反復(fù)凍融可能使產(chǎn)品性能下降。

使用本產(chǎn)品前，一定要完全融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，盡量避免起泡。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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