產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱(chēng)	英文名稱(chēng)	規(guī)格	貨號(hào)
一步法熒光定量RT-PCR試劑盒(探針?lè)?/span>)	ByFast One-Step Probe qRT-PCR Kit	20μL×100T\|20μL×500T	CS-01F97513

試劑盒是一種基于TaqMan等探針的用于一步法反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR，主要用于RNA的特異性高靈敏度定量檢測(cè)。由于使用的探針一般是TaqMan探針，所以本方法也常稱(chēng)作TaqMan探針?lè)ā?/span>

本試劑盒以提取的RNA為模版，使用qPCR引物在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，操作簡(jiǎn)單快速，大限度地減少人為誤差，有效降低污染風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)約PCR實(shí)驗(yàn)的操作時(shí)間，檢測(cè)通量大。

本試劑盒整合了高效的BalbRT M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor和優(yōu)異的抗體結(jié)合型熱啟動(dòng)ByFast Taq DNA Polymerase，并優(yōu)化了緩沖體系，反轉(zhuǎn)錄性能優(yōu)、檢測(cè)靈敏度高、擴(kuò)增特異性、反應(yīng)穩(wěn)定性好，非常適合于內(nèi)源低豐度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的檢測(cè)。

檢測(cè)原理：

探針?lè)?/span>qPCR不使用熒光染料如SYBR Green等對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光染色，而是采用了熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)(quencher)標(biāo)記的DNA探針靶向擬通過(guò)PCR檢測(cè)的目標(biāo)序列(設(shè)計(jì)的探針結(jié)合位點(diǎn)通常位于兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間)。正常情況下，探針上的淬滅基團(tuán)由于空間上的熒光共振能力轉(zhuǎn)移(FRET)而導(dǎo)致熒光基團(tuán)淬滅。在PCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列時(shí)，引物和探針都會(huì)退火到目標(biāo)基因上，隨著引物的延伸，Taq酶的5'→3'外切酶活性會(huì)導(dǎo)致結(jié)合在目標(biāo)序列上的探針從5’端開(kāi)始逐漸被降解。探針的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)被Taq酶切開(kāi)后，淬滅基團(tuán)的作用消失，熒光基團(tuán)就能正常地被激發(fā)光所激發(fā)而產(chǎn)生熒光了。每經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR循環(huán)，就會(huì)有更多的熒光基團(tuán)被釋放，熒光度與新合成的目標(biāo)片段數(shù)量成正比，從而就可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)了。探針通常是目標(biāo)序列特異性的一段線(xiàn)性DNA，5'端標(biāo)記FAM或HEX等熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ1、TAMRA或MGB等熒光淬滅基團(tuán)。
保存：-20℃避光，盡量避免反復(fù)凍融，有效期2年。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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