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本制品中的Bst DNA Polymerase HD為經(jīng)重構(gòu)架設(shè)計(jì)的Bst DNA聚合酶，其保留了Bst DNA聚合酶的鏈置換活性，并提高了其溫度耐受性，該酶可以耐受85℃。這種短暫的高溫耐熱性能，使得該酶介導(dǎo)的LAMP反應(yīng)具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：

在高溫85℃加熱2min后，可以將雙鏈DNA進(jìn)行變性，提高了引物的結(jié)合能力，從而提高LAMP檢測(cè)的靈敏度；

在未經(jīng)處理的檢測(cè)樣本中，可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)裂解樣本（從組織中釋放DNA），從而實(shí)現(xiàn)核酸免提取的LAMP擴(kuò)增；

在高溫條件下打開(kāi)引物的非特異性結(jié)構(gòu)，明顯降低LAMP反應(yīng)的非特異性擴(kuò)增；

短暫的高溫可瞬時(shí)滅活病毒，降低檢測(cè)樣品的生物安全性。

LAMP是一種新型的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，在恒溫條件下，呈指數(shù)級(jí)別放大核酸分子，30分鐘內(nèi)將DNA放大109～1010倍。其快速、恒溫的獨(dú)特技術(shù)優(yōu)勢(shì)，使得LAMP技術(shù)成為開(kāi)發(fā)診斷試劑的明星潛力技術(shù)。由于在LAMP擴(kuò)增中用到很高濃度的引物，因此難免保證有少量錯(cuò)配和引物Dimer，這些輕微的污染都會(huì)導(dǎo)致LAMP高速的擴(kuò)增中造成假陽(yáng)性檢測(cè)。我公司*出色的陰性控制技術(shù)建立了全新的LAMP檢測(cè)平臺(tái)。

儲(chǔ)存：長(zhǎng)期保存于-20℃，保存2年。短期保存置于4℃，保存3個(gè)月，避免反復(fù)凍融。

2.5μl的Bst DNA Polymerase HD包含8U Bst DNA Polymerase HD、22%海藻糖。不含甘油，因此可用于建立LAMP引物mix與酶制品的凍干品，以提高LAMP檢測(cè)制品的穩(wěn)定性和易用性。
2×Hot LAMP Buffer D已包含dNTP、Mg2+和相應(yīng)的反應(yīng)緩沖鹽。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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