產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
一步法熒光定量RT-PCR試劑盒(SYBR Green)	ByFast SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit	100T\|500T	CS-01F97494

本試劑盒是一種基于SYBR Green染料用于一步法反轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR，即qRT-PCR或real-time RT-PCR的高品質(zhì)預(yù)混液，主要用于RNA的特異性高靈敏度定量檢測。

本試劑盒以提取的RNA為模版，使用qPCR引物在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，操作簡單快速，大限度地減少人為誤差，有效降低污染風(fēng)險，節(jié)約PCR實(shí)驗(yàn)的操作時間，檢測通量大。

本試劑盒整合了高效的BalbRT M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor和優(yōu)異的抗體結(jié)合型熱啟動ByFast Taq DNA Polymerase，并優(yōu)化了緩沖體系，反轉(zhuǎn)錄性能優(yōu)、檢測靈敏度高、擴(kuò)增特異性、反應(yīng)穩(wěn)定性好，非常適合于內(nèi)源低豐度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的檢測。

本試劑盒使用SYBR Green I作為染料。SYBR Green I是一種結(jié)合于雙鏈DNA(double-strand DNA,dsDNA)雙螺旋小溝區(qū)域的綠色熒光染料。SYBR Green I在游離狀態(tài)下的熒光比較微弱，一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光會大大增。這樣通過檢測熒光弱就可以定量檢測PCR過程中擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈DNA的數(shù)量。

本試劑盒使用的ByFast Taq DNA Polymerase是一種與抗體結(jié)合的高品質(zhì)熱啟動酶，能夠?qū)崿F(xiàn)便捷高效的熱啟動。ByFast Taq DNA Polymerase中的Taq酶與抗Taq酶的單克隆抗體相互結(jié)合，從而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，這樣可以有效避免在低溫條件下由引物和模板DNA非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)的預(yù)變性步驟中抗體會被加熱失活，這樣可以確保僅在預(yù)變性后才會把Taq酶的活性釋放出來，預(yù)變性之前不會發(fā)生DNA聚合反應(yīng)，從而大大提高了PCR反應(yīng)的特異性、靈敏度和定量檢測的準(zhǔn)確性。
保存：-20℃避光，盡量避免反復(fù)凍融，有效期2年。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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