產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液(SYBR Green I)	2×ByFast SYBR Green qPCR Mix	1mL\|5×1mL\|25×1mL	CS-01F97493

本制品是一種用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，即qPCR(Quantitative PCR)或real-time PCR的高品質(zhì)預(yù)混液，主要用于cDNA和基因組DNA等的特異性高靈敏度定量檢測(cè)。

本制品使用SYBR Green I作為染料。SYBR Green I是一種結(jié)合于雙鏈DNA(dsDNA)雙螺旋小溝區(qū)域的綠色熒光染料。SYBR Green I在游離狀態(tài)下的熒光比較微弱，一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光會(huì)大大增。這樣通過檢測(cè)熒光弱就可以定量檢測(cè)PCR過程中擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈DNA的數(shù)量。

本制品使用的ByFast Taq DNA Polymerase是一種與抗體結(jié)合的高品質(zhì)熱啟動(dòng)酶，能夠?qū)崿F(xiàn)便捷高效的熱啟動(dòng)。ByFast Taq DNA Polymerase中的Taq酶與抗Taq酶的單克隆抗體相互結(jié)合，從而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，這樣可以有效避免在低溫條件下由引物和模板DNA非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)的預(yù)變性步驟中抗體會(huì)被加熱失活，這樣可以確保僅在預(yù)變性后才會(huì)把Taq酶的活性釋放出來，預(yù)變性之前不會(huì)發(fā)生DNA聚合反應(yīng)，從而大大提高了PCR反應(yīng)的特異性、靈敏度和定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

本制品包含了ByFast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I熒光染料、穩(wěn)定劑和鎂離子等所有的通用組分，使操作更簡(jiǎn)單、使用更便捷。用戶只需自備引物、樣品DNA和去離子水即可。

保存：-20℃避光保存，一年有效；4℃避光保存，一個(gè)月內(nèi)有效。盡量避免反復(fù)凍融。

規(guī)格說明：

本制品如果用于常規(guī)的96孔板qPCR檢測(cè)(建議反應(yīng)體系為20μL)，每mL本產(chǎn)品可以進(jìn)行100次檢測(cè)；如果用于常規(guī)的384孔板qPCR檢測(cè)(建議反應(yīng)體系為10μL)，每mL本產(chǎn)品可以進(jìn)行200次檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

使用前需確保整管試劑完全融化，上下顛倒輕輕混勻后使用。混勻過程中盡量避免產(chǎn)生氣泡。

注意引物退火溫度，當(dāng)退火溫度<60℃時(shí)，推薦使用三步法PCR擴(kuò)增。

本制品中含有SYBR Green I熒光染料，保存本產(chǎn)品或設(shè)置PCR反應(yīng)時(shí)應(yīng)避免光照射，以盡量避免熒光淬滅問題。

對(duì)于過350bp或者高GC含量的擴(kuò)增片段，建議增加延伸時(shí)間至60秒或者采用三步法以提高擴(kuò)增效率。

經(jīng)測(cè)試，本制品反復(fù)凍融10次對(duì)使用效果無顯著影響。但仍需盡量避免反復(fù)凍融本產(chǎn)品，反復(fù)凍融可能使產(chǎn)品性能下降。
qPCR檢測(cè)是高靈敏度的檢測(cè)，PCR反應(yīng)設(shè)置區(qū)域需盡量避免各種可能的待擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。PCR產(chǎn)物宜密封后丟棄，以避免高濃度的PCR產(chǎn)物污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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