產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
qPCR MasterMix(TaqMan探針法，高濃度ROX)	2×ByFast Probe qPCR Mix(High ROX)	1mL\|5mL\|25mL	CS-01F97485

本制品是一種基于TaqMan等探針的用于實時熒光定量PCR，即探針法qPCR(Quantitative PCR)或real-time PCR的高品質(zhì)預(yù)混液，主要用于cDNA和基因組DNA等的特異性高靈敏度定量檢測。由于使用的探針一般是TaqMan探針，所以本方法也常稱作TaqMan探針法。

本產(chǎn)品特別適合用于低豐度或高特異性的目的基因的定量或定性檢測。例如一些低豐度的mRNA、lncRNA、小RNA、微生物RNA反轉(zhuǎn)錄后的高靈敏度檢測，一些相似度較高的常規(guī)染料法難以區(qū)分的同源基因或者基因的SNP檢測。

本產(chǎn)品的特異性好、靈敏度高：特異性并不僅僅依賴于PCR引物，還依賴于探針的特異性，探針和目標基因發(fā)生特異性的結(jié)合和降解，才能生成熒光信號，檢測靈敏度和特異性通常要顯著高于使用SYBR Green等熒光染料的方法。

本產(chǎn)品可用于多重檢測：單個反應(yīng)孔中，不同基因?qū)?yīng)不同探針，不同探針對應(yīng)不同熒光標記，即可進行多重熒光定量PCR檢測。經(jīng)測試，在適當優(yōu)化引物和探針后，本產(chǎn)品可同時用于2～3個基因的檢測。

本產(chǎn)品使用的ByFast Taq DNA Polymerase是一種與抗體結(jié)合的高品質(zhì)熱啟動酶，能夠?qū)崿F(xiàn)便捷高效的熱啟動。ByFast Taq DNA Polymerase中的Taq酶與抗Taq酶的單克隆抗體相互結(jié)合，從而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，這樣可以有效避免在低溫條件下由引物和模板DNA非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增。在PCR反應(yīng)的預(yù)變性步驟中抗體會被加熱失活，這樣可以確保僅在預(yù)變性后才會把Taq酶的活性釋放出來，預(yù)變性之前不會發(fā)生DNA聚合反應(yīng)，從而大大提高了PCR反應(yīng)的特異性、靈敏度和定量檢測的準確性。
本產(chǎn)品包含了ByFast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、穩(wěn)定劑和鎂離子等所有的通用組分，使操作更簡單、使用更便捷。用戶只需自備引物、探針、樣品DNA和去離子水即可。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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