產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
探針法熒光定量RT-PCR凍干試劑盒(UNG酶)	Lyophilized TaqMan RT-PCR Kit(UNG)	20μL×200T\|20μL×1000T	CS-01F97475

本試劑盒是以RNA為模板采用TaqMan探針法進行Real-Time PCR的專用試劑，適合于FAM/HEX/TET/JOE/ROX等雙標記探針（本品也適用于Molecular Beacon探針），其中凍干RT-PCR試劑將熱啟動Fast Taq DNA聚合酶、耐熱反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs等做成凍干品試劑，制品性能穩(wěn)定，可長期保存。當加入2×TaqMan Buffer溶解后，試劑成為常規(guī)一步式探針法RT-PCR單組分預(yù)混試劑，進行實驗時，PCR反應(yīng)液的配制十分方便簡單，只需加入引物、探針、RNA模板、水即可。該制品不含有ROX校正染料，適用于適合于各種熒光標記探針，并且適用于各種定量PCR機型，常用于RNA的相對定量檢測，及基因檢測和基因診斷試劑開發(fā)。

該凍干RT-PCR試劑中的耐熱反轉(zhuǎn)錄酶具有的熱穩(wěn)定性，在55℃條件下仍然保留90%以上的聚合活性。制品中的Fast Taq DNA聚合酶采用專有的熱啟動技術(shù)確保55℃以下沒有任何活性，因此可在室溫建立反應(yīng)體系。Fast Taq DNA聚合酶具有的擴增速度，因此滿足快速PCR程序，通常在30min以內(nèi)可以完成擴增反應(yīng)。同時該聚合酶具有耐受雜質(zhì)的能力，同樣適用于粗制核酸樣本的擴增反應(yīng)。

由于PCR對核酸的擴增效率極高，在診斷PCR實驗中，非常容易造成移液器、臺面、PCR儀、空氣等氣溶膠污染。當實驗環(huán)境被污染后，會導(dǎo)致陰性樣本的假陽性結(jié)果。本試劑中，將dNTP中的dTTP全部更換為dUTP，從而使得擴增后的PCR產(chǎn)物中包含dU堿基。在隨后的實驗中，含有氣溶膠污染的dU PCR產(chǎn)物，將被本試劑中的UNG糖基化酶降解，從而去除了氣溶膠的污染效應(yīng)，本試劑中的UNG酶在37℃孵育2分鐘，即可消除高達10萬個Copy的核酸污染物。因此，本制品是診斷定量PCR檢測的佳試劑。

試劑盒特點：

· 引入UNG，可高效消除氣溶膠污染；

· 熱啟動酶采用專有的修飾方式，30s熱啟動；

· 凍干粉制品，性能及其穩(wěn)定；

· 一步法RT-qPCR預(yù)混試劑；

· 的擴增性能，耐受樣本中的雜質(zhì)能力；
· 適用于所有實時定量PCR儀器；

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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