產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
一步法RT-qPCR試劑盒（探針法)	QuickKing One Step RT-qPCR Kit（Probe)	50μl×50次\|50μl×200次	CS-01F97363

介紹

本試劑盒中的25×QuickKing Enzyme Mix為我司新型逆轉(zhuǎn)錄酶（King RTase)、新型抗體修飾的熱啟動Taq DNA聚合酶及RNase Inhibitor的預混Mix形式，其中的King RTase是分子改造后的新型逆轉(zhuǎn)錄酶，特別增加了疏水motif，具有更的RNA親和性和熱穩(wěn)定性，提高了該酶的逆轉(zhuǎn)錄效率和對具有復雜二級結構RNA模板的延伸能力；PCR過程中采用了性能優(yōu)良的新型熱啟動Taq DNA聚合酶，使得逆轉(zhuǎn)錄后的PCR反應具更高的擴增效率和特異性。另外，本產(chǎn)品中的2×QuickKing One Step Probe RT-qPCR Master Mix是專門為上述兩種關鍵酶而優(yōu)化的新型反應體系，其中包含必要離子組分、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增劑，可保證King RTase和新型熱啟動Taq DNA聚合酶在整個一步法反應過程中發(fā)揮大功效。

本試劑盒是采用探針法（TaqMan,Molecular Beacon等)進行一步法RT-qPCR的專用試劑。使用本制品進行Real Time One Step RT-qPCR反應可在同一反應管內(nèi)連續(xù)進行，操作簡單，避免了樣品間交叉污染的同時也提高了檢測的靈敏度。

本試劑盒可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標準曲線，對多種高低豐度的靶基因進行準確定量檢測，重復性好，可信度高。RT-qPCR技術可用于檢測樣本中目的基因表達水平及RNA病毒的含量。

產(chǎn)品特點：

·反應靈敏高效：性能優(yōu)良的逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶保證了極高的反應效率；

·操作簡單快速：雙組分的產(chǎn)品形式使得操作過程變得簡單快速；

·解決復雜模板：通讀GC含量高，二級結構復雜的RNA模板；

·樣品普適性好：對不同物種來源及雜質(zhì)較多的RNA模板的適用性高。
儲存條件：-20℃保存，保質(zhì)期1年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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