產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
HRM分析試劑盒（染料法)	HRM Analysis Kit （EvaGreen)	20μl×125次\|20μl×500次	CS-01F97362

介紹

本試劑盒結合了飽和染料EvaGreen和抗體酶的優(yōu)點，是一款適用于高分辨率熔解曲線（High Resolution Melting，HRM）分析的專業(yè)試劑盒。本品是一種2× PreMix，PCR反應液配制十分簡單方便；具有分辨率高和模板高度適應性等特點。與SYBR Green不同，EvaGreen在高濃度情況下不會抑制PCR反應；可以使雙鏈PCR產(chǎn)物的結合量達到飽和狀態(tài)，所以稱為“飽和染料”。不會產(chǎn)生SYBR Green的“染料重排”現(xiàn)象，能夠很好的區(qū)分擴增產(chǎn)物之間單個堿基的差異。本產(chǎn)品可用于已知SNP分析，未知SNP篩選，以及未知突變基因掃描和甲基化PCR分析等研究。

產(chǎn)品特點：

·高分辨率：采用EvaGreen飽和染料，在飽和狀態(tài)下具很高的熔解曲線分辨率，可以區(qū)分單個堿基的變異。

·高特異性：采用抗體修飾的熱啟動DNA聚合酶，降低非特異性擴增，提高特異性。

·高穩(wěn)定性：精心優(yōu)化Buffer體系，增加了熔解曲線的穩(wěn)定性，提高結果可信度。

· ROX校正：單獨包裝的ROX染料，使用更靈活，結果更準確。

試劑盒原理：

SYBR Green是目前被廣泛應用于熒光定量PCR分析的熒光染料，但由于對PCR的抑制較嚴重，會被控制在較低的使用濃度，SYBR Green與雙鏈DNA的結合處于非飽和狀態(tài)，所以稱為“非飽和染料”。SYBR Green的這種性質(zhì)會導致在“染料重排”現(xiàn)象的發(fā)生，從而影響熔解曲線的分辨率，所以不能夠通過熔解曲線區(qū)分擴增產(chǎn)物之間單個堿基之間的差異。
EvaGreen是一種同時適用于熒光定量PCR和HRM分析的新一代染料。這種染料通過一種被稱為“按要求釋放”的全新機制，選擇性的結合雙鏈DNA。這一機制保證了較低的PCR抑制作用，同時也允許在染料飽和濃度下進行分辨單堿基差異的HRM分析。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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