產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
lncRNA熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green)	lnRsmart lncRNA qPCR kit	20μl×125次\|20μl×500次	CS-01F97361

介紹

本試劑盒基于SYBR Green I嵌合熒光法的原理，可對(duì)目標(biāo)lncRNA進(jìn)行快速、特異性的定量檢測(cè)。與mRNA相比，lncRNA具有豐度低、GC含量差異大、二級(jí)結(jié)構(gòu)更復(fù)雜等特性，傳統(tǒng)定量試劑對(duì)lncRNA難以達(dá)到理想的效果。

本試劑盒中的2×lnRsmart lncRNA PreMix是專門(mén)為lncRNA定量檢測(cè)而研發(fā)的新一代預(yù)混形式的熒光定量PCR檢測(cè)試劑，其中的DNA聚合酶采用的是抗體修飾的熱啟動(dòng)形式，配合特殊優(yōu)化的Buffer體系，可確保本試劑盒在保證較高的反應(yīng)特異性的情況下具有更高的檢測(cè)靈敏度。此外，Buffer中添加了的H-competitor因子和EP組分，使得本試劑盒具有廣泛的樣本普適性，對(duì)不同GC含量的模板、具有復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)的模板、PCR抑制劑殘留較多的模板以及長(zhǎng)片段模板等具有非常好的擴(kuò)增適用性，特別適合高級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，整體豐度相對(duì)較低的lncRNA的定量檢測(cè)。此外，優(yōu)化的預(yù)混液可縮短Real-Time PCR的反應(yīng)時(shí)間，適用于標(biāo)準(zhǔn)或快速定量的PCR反應(yīng)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

操作簡(jiǎn)便：2×lnRsmart lncRNA PreMix中預(yù)混有SYBR Green I，PCR反應(yīng)液配制時(shí)，只需加入模板、引物、滅菌蒸餾水便可進(jìn)行快速Real-Time PCR反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單方便。

普適性好：本試劑盒中特別添加了H-Competitor因子，能夠競(jìng)爭(zhēng)氫鍵、增雙鏈的打開(kāi)度，使本產(chǎn)品具有廣泛的樣本普適性，對(duì)具有復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)的模板和長(zhǎng)片段擴(kuò)增等具有非常好的適用性。

性能：本試劑盒特制的快速PCR Buffer體系含有獨(dú)特的PCR穩(wěn)定因子——EP，能夠有效的保護(hù)酶活，抵御各種PCR抑制劑的干擾，保證了2×lnRsmart lncRNA PreMix具有高擴(kuò)增效率、高擴(kuò)增特異性、高擴(kuò)增靈敏度和寬廣的可信范圍的特點(diǎn)。

定量準(zhǔn)確：本試劑盒附帶ROX Reference Dye，用于消除信號(hào)本底以及校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號(hào)誤差，方便客戶針對(duì)不同型號(hào)熒光定量PCR儀時(shí)選擇對(duì)應(yīng)濃度使用。
穩(wěn)定性好：2×lnRsmart lncRNA PreMix采用無(wú)色透明管包裝，經(jīng)檢測(cè)，光照不會(huì)影響體系的定量的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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