產(chǎn)品目錄

microRNAs（miRNAs)是一類由18～25核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA，具有表達(dá)的時(shí)序性、序列嚴(yán)格的保守性、組織器官表達(dá)量的相對(duì)特異性等特點(diǎn)，在細(xì)胞分化，生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮巨大作用。

隨著miRNA相關(guān)研究在迅速增加，為了方便客戶，我們推出了miRNA引物系列產(chǎn)品。該引物數(shù)據(jù)庫(kù)中為miRNA熒光定量檢測(cè)的上游引物；所有引物庫(kù)中的引物已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。驗(yàn)證樣本miRNA mimics，經(jīng)過(guò)我司miRNA cDNA鏈合成試劑盒（WH0131）合成cDNA后，配合我司miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒（WH0132）及試劑盒中的下游引物進(jìn)行熒光定量驗(yàn)證。

使用方法：

本品為粉末狀引物干粉，請(qǐng)根據(jù)說(shuō)明書(shū)中標(biāo)注的分子量使用RNA-free ddH2O進(jìn)行溶解，配置成100μM的儲(chǔ)存液，工作液濃度為10 μM。

建議開(kāi)蓋前先短暫離心，輕啟管蓋，以免粉末損失。

溶解后的引物建議分裝后保存，以免在操作中出現(xiàn)污染和反復(fù)凍融造成的不利影響。

溶解后的引物請(qǐng)?jiān)?/span>-20度冰箱中保存。

本試劑盒采用SYBR Green I嵌合熒光法的原理進(jìn)行miRNA熒光定量檢測(cè)。本試劑盒中的2×miRNA PreMix是專門為miRNA定量檢測(cè)而研發(fā)的新一代預(yù)混形式的熒光定量PCR檢測(cè)試劑，其中的DNA聚合酶采用的是化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)形式，配合特殊的Buffer體系，使反應(yīng)特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

試劑盒特點(diǎn)：

靈敏度高：可在pg級(jí)的總RNA中檢測(cè)到目的miRNA。

特異性：體系全新升級(jí)，更好的區(qū)分單堿基的差異，區(qū)分家族中的不同miRNA。
通用性好：適用于各種類型的熒光定量PCR儀。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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