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擴增預混液中的Ultra HiFi DNA Polymerase是通過定向分子進化技術(shù)開發(fā)得到的新型快速高保真DNA聚合酶，增了DNA聚合酶對模板的親和力，使得此酶在擴增速度和延伸能力上得到了提升，增加了PCR成功率和產(chǎn)物量。同時，此酶具有優(yōu)良的3'- 5'外切酶活性（Proofreading活性），保真性可達市場上主流產(chǎn)品水平，保證了基因和文庫擴增過程中的真實性。此外，本產(chǎn)品中的DNA聚合酶具有熱啟動（Hot Start）功能，可有效的控制低溫情況下的非特異擴增和酶活損耗，進而保證了PCR擴增的特異性和穩(wěn)定性。

本產(chǎn)品為一管式預混Mix形式，內(nèi)含熱啟動型的Ultra HiFi DNA Polymerase、純dNTPs、MgCl2、反應緩沖液等PCR反應所需組分，只需加入模板和引物即可進行PCR擴增反應，操作簡便。除此之外，預混Mix中還整合了PCR反應增系統(tǒng)，不但提高了預混Mix的穩(wěn)定性，使得聚合酶對PCR反應抑制劑的耐受能力增，還提高了Ultra HiFi DNA Polymerase對不同GC含量模板的適應能力，使得本產(chǎn)品具有廣泛的樣品普適性和模板投入范圍，將PCR反應的偏好性降至低。

產(chǎn)品特點：

·擴增快速：延伸速度可達10-15 sec/kb；延伸力：可擴增長至15 kb的DNA片段；

·特異性好：具有熱啟動功能，可用于多重PCR；

·靈敏度高：模板用量可低至10pg；

·偏好性低：針對不同GC含量的模板都有均衡的擴增效果；
·應用廣泛：可用于高通量測序文庫的PCR擴增和其他PCR相關(guān)的克隆和檢測。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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