產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
2×Taq PCR預混反應液	2×Taq PCR Mastermix	1ml（不含染料)\|5×1ml（不含染料)\|1ml（含藍色染料)\|5×1ml（含藍色染料)	CS-01F97331

本制品包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應的增劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑，濃度為2×。具有快速簡便、靈敏度高、特異性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可大限度的減少人為誤差。適用于高保真PCR反應、復雜模板如GC含量高（>60%），有二級結構等的擴增和大規(guī)?；驒z測。

本制品使用方便快捷，能避免PCR操作過程中的污染，使用時只需取適量2×Taq PCR MasterMix溶液，加入模板和引物，并加入ddH2O水補足體積，使MasterMix溶液的濃度為1×即可進行反應。產(chǎn)品有加染料（為藍色）和不加染料（為無色）兩種；加染料的產(chǎn)品反應完成后，產(chǎn)物可直接電泳。

產(chǎn)品特點：

·顯著提高PCR反應的特異性和靈敏度，還能有效擴增GC含量高、二級結構等復雜模板。低可擴增2個拷貝的目的模板，使實驗結果更加精確。

·獨特的Taq MasterMix配方使整個反應體系非常穩(wěn)定，多次凍融或長期放于4℃亦不會影響活性。

·穩(wěn)定高效預配好的PCR混合液快速簡便，大大降低勞動度和取樣誤差，而且加入了高性能的PCR增劑和優(yōu)化劑，降低了對PCR條件的要求。

·分成含染料和不含染料兩種體系。含染料的MasterMix產(chǎn)品在PCR結束后可以直接電泳，無需加入上樣緩沖液。

適用范圍：

·基因檢測：本產(chǎn)品不同批次之間誤差很小，特別適合大規(guī)?；驒z測，半定量PCR實驗和微量DNA的檢測。

· DNA擴增和一些有特殊結構的復雜模板如GC含量高（>60%），有二級結構等的擴增：DNA片段的PCR擴增、DNA標記、引物延伸、序列測定等。
· PCR產(chǎn)物帶A，純化后可直接用T/A載體克隆。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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