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產品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
Real-Time PCR預混反應液（染料法)	SuperReal PreMix Plus（SYBR Green)	125次\|500次\|5000次	CS-01F97313

本制品是Real-Time PCR專用試劑，使用簡單方便，獨特雙組分熱啟動DNA聚合酶，添加獨特H-Bond因子的Buffer體系和單獨包裝的ROX等優(yōu)點外，因對Buffer精心調整，可更有效地減少引物二聚體和非特異性擴增的產生，使其具有更高的擴增特異性和廣泛模板適應性的特點。

本試劑盒采用了獨特的雙組分熱啟動DNA聚合酶進行PCR擴增，通過檢測反應進程中SYBR Green I的熒光度，達到檢測PCR產物擴增量的目的。

本試劑盒中雙熱啟動酶構成了獨特的酶活自動調節(jié)系統(tǒng)。酶活自動調節(jié)系統(tǒng)是由化學修飾的HotStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶組成。其中HotStar Taq DNA聚合酶占絕大部分比例，其聚合酶活性的激活是嚴格依賴于95℃高溫的一個緩釋過程，而Anti Taq DNA聚合酶則在95℃高溫下完全激活。經過95℃條件下孵育15min激活大部分HotStarTaq DNA聚合酶，進入PCR循環(huán)后，每經過一輪95℃條件下變性，即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶獨特的酶活緩釋機制使其可以與Anti Taq DNA聚合酶構成獨特的酶活自動調節(jié)系統(tǒng)。PCR反應初期，完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以協同已經激活的HotStar Taq DNA聚合酶達到佳酶活狀態(tài)，而在整個PCR反應過程中，每一輪新釋放的HotStart Taq DNA聚合酶活力剛好可以彌補因熱變性所導致的部分酶活損失。因此，SuperReal PreMix Plus在整個PCR反應過程始終保持佳的DNA聚合酶活力，配合精心優(yōu)化Buffer體系，從而可以獲得高擴增效率，高擴增特異性和更加廣泛性的模板適應性。

產品特點：

· SuperReal PreMix Plus采用了獨特的雙組分熱啟動DNA聚合酶（化學修飾的HotStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶)，從而構成酶活自動調節(jié)系統(tǒng)，配合精心優(yōu)化buffer體系，具有高擴增效率，高擴增特異性和寬廣的可信范圍的特點。

·本產品Buffer體系平衡了K+和NH4+的比例，還特別添加了獨特的H-Bond因子,能協同調整反應體系中的氫鍵作用力，使引物模板退火條件更加嚴謹，反應的專一性增，重復性更好。

· SuperReal PreMix Plus中預混有SYBR Green I，PCR反應液配制時，只需加入模板、引物、滅菌蒸餾水便可進行Real Time PCR反應，操作簡單方便。
·本產品附帶ROX Reference Dye，用于消除信號本底以及校正孔與孔之間產生的熒光信號誤差，方便客戶針對不同型號熒光定量PCR儀時選擇對應濃度使用。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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