產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
Real-Time PCR預(yù)混反應(yīng)液（探針法)	SuperReal PreMix（Probe)	125次\|500次\|5000次	CS-01F97312

本制品是采用探針法進(jìn)行Real-Time PCR的專用試劑，為2×濃度的PreMix形式，反應(yīng)液配制十分簡單方便。采用了獨(dú)特的雙組分熱啟動DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過在PCR反應(yīng)液中加入熒光探針，然后檢測反應(yīng)進(jìn)程中的熒光度，達(dá)到檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。采用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real Time PCR時，建議使用SuperReal PreMix Plus （SYBR Green)（WH0103）

本制品中雙熱啟動酶構(gòu)成了獨(dú)特的酶活自動調(diào)節(jié)系統(tǒng)。酶活自動調(diào)節(jié)系統(tǒng)是由化學(xué)修飾的HotStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶組成。其中HotStar Taq DNA聚合酶占絕大部分比例，其聚合酶活性的激活是嚴(yán)格依賴于95℃高溫的一個緩釋過程，而Anti Taq DNA聚合酶則在95℃高溫下完全激活。經(jīng)過95℃條件下孵育15min激活大部分HotStar Taq DNA聚合酶，進(jìn)入PCR循環(huán)后，每經(jīng)過一輪95℃條件下變性，即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶獨(dú)特的酶活緩釋機(jī)制使其可以與Anti Taq DNA聚合酶構(gòu)成獨(dú)特的酶活自動調(diào)節(jié)系統(tǒng)。PCR反應(yīng)初期，完全激活的AntiTaq DNA聚合酶可以協(xié)同已經(jīng)激活的HotStar Taq DNA聚合酶達(dá)到佳酶活狀態(tài)，而在整個PCR反應(yīng)過程中，每一輪新釋放的HotStart Taq DNA聚合酶活力剛好可以彌補(bǔ)因熱變性所導(dǎo)致的部分酶活損失。因此，SuperReal PreMix在整個PCR反應(yīng)過程始終保持佳的DNA聚合酶活力，配合精心優(yōu)化Buffer體系，從而具有定量準(zhǔn)確，擴(kuò)增效率高，重復(fù)性好和寬廣的可信范圍的特點(diǎn)。

本制品經(jīng)過優(yōu)化特別有利于Taq酶發(fā)揮其5′-3′外切酶活性，使熒光信號的釋放達(dá)到佳的效果。此外，SuperRealPreMix（Probe)也充分降解了探針熒光淬滅基團(tuán)的信號釋放，經(jīng)過上述優(yōu)化，用相同量的模板將得到更的信號。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

· SuperReal PreMix （Probe)采用了獨(dú)特的雙組分熱啟動DNA聚合酶（化學(xué)修飾的HotStar TaqDNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶），從而構(gòu)成酶活自動調(diào)節(jié)系統(tǒng)，配合精心優(yōu)化的buffer體系，具有定量準(zhǔn)確，擴(kuò)增效率高，重復(fù)性好和寬廣的可信范圍的特點(diǎn)。

·本產(chǎn)品經(jīng)過優(yōu)化使熒光信號的釋放達(dá)到佳的效果，同時充分降解了探針熒光淬滅基團(tuán)的信號釋放，用相同量的模板將得到更的信號。

· SuperReal PreMix （Probe)為2×濃度的PreMix形式，PCR反應(yīng)液配制時，只需加入模板、引物、滅菌蒸餾水便可進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，操作簡單方便。
·本產(chǎn)品附帶ROX Reference Dye，用于消除信號本底以及校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號誤差，方便客戶針對不同型號熒光定量PCR儀時選擇對應(yīng)濃度使用。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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