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本公司生產(chǎn)的Pfu DNA Ploymerase是從克隆有Pyrococcusfuriosis DNA Ploymerase基因的大腸桿菌中表達(dá)并經(jīng)過柱純化分離出來的重組蛋白，其分子量為90kDa。由于Pfu酶具有3’→5’核酸外切酶活性，它能糾正DNA擴增過程中產(chǎn)生的錯配，而傳統(tǒng)的Taq酶卻不能，其它耐熱DNA Polymerase如Vent、Deep Vent、Tli、UITma等雖具有校正功能，但Pfu酶是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐熱DNA Polymerase中出錯率低的。Pfu酶無5’→3’核酸外切酶活性，PCR反應(yīng)中的延伸速度一般為0.5-1kb/分鐘，比Taq酶要低。Pfu 酶比Taq酶熱穩(wěn)定性更好，95℃ 1小時仍保持90%以上的活性，對于GC含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃而不影響其活性。Pfu酶的PCR產(chǎn)物為平末端，可加A處理再與T-載體連接或使用平末端克隆載體。一般用于DNA的高保真擴增，如基因表達(dá)克隆、基因定點突變、細(xì)胞內(nèi)基因點突變分析(SNP)和末端補平等。。

Pfu來源：表達(dá)Pfu DNA聚合酶的大腸桿菌。

Pfu酶儲存緩沖液：50mMTris-HCl，pH 8.2;0.1mM EDTA;1mM DTT;0.1% Nonidet P40;0.1% Tween 20;50% 甘油。

Pfu單位定義：在74℃條件下，30分鐘內(nèi)催化10 nmmoldNTP的摻入反應(yīng)成為酸不溶性物質(zhì)所需要的酶量為一個單位。

Pfu用途：1)常規(guī)PCR反應(yīng)中的DNA高保真體外擴增;

2)基因定點突變和拼接。

Pfu注意事項：

1、酶濃度：建議在50ml的體系中使用1.25個單位的Pfu DNA聚合酶，因為酶存在3’-5’外切酶活性，高濃度的酶可能會增加降解引物的可能性。好在加完dNTP后再添加Pfu DNA聚合酶。并在有冰浴的條件下混合PCR反應(yīng)中的各種成分。

2、延伸時間：Pfu DNA聚合酶的延伸速率低于Taq DNA聚合酶，大約為一分鐘600個堿基(Taq DNA聚合酶大約為一分鐘2000個堿基)，因此建議擴增1Kb的DNA用兩分鐘的延伸時間。對于大多數(shù)的反應(yīng)而言，25～35個擴增循環(huán)就足夠了。

Pfu保存：-20℃保存至少一年。

別名：Pfu DNA 聚合酶

英文名稱：Pfu DNA Polymerase

儲存條件：-20
性狀：液體

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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