產(chǎn)品目錄

本制品是將PCR反應(yīng)所需的Fast Pfu酶、dNTP、MgCl2、反應(yīng)緩沖液以及優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑，預(yù)先配制成2倍濃度的混合物。2×Fast Pfu PCR MasterMix專為擴(kuò)增克隆DNA片段優(yōu)化，高保真，錯誤率僅為1.3x10-6。使用時只需在加入模板和引物并稀釋到1倍濃度即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，非常方便。較普通Pfu酶，2×Fast Pfu PCR MasterMix具有快速、高靈敏度、抗干擾能力等特點(diǎn)，能獲得更理想的擴(kuò)增結(jié)果，并大幅度縮短擴(kuò)增反應(yīng)時間。

本制品用于要求保真度比較高的PCR反應(yīng)，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突變、全基因合成等。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

高保真：具有同Pfu酶相同的保真度，為普通Taq酶的10倍。

快速：Fast Pfu擴(kuò)增速度為普通Pfu酶的數(shù)倍，72℃保溫30秒可延伸1kb以上。

靈敏：可從0.05ng人基因組DNA模板中擴(kuò)增出特定基因片段

快捷：PCR反應(yīng)所必需試劑全集于一管之中，數(shù)分鐘即可完成反應(yīng)體系配制。

便利：10μl,25μl或50μl體系全部適用。

使用建議：

Fast Pfu DNA聚合酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為平滑末端，無3′端"A"突出，其PCR產(chǎn)物的克隆有兩種方案：

1、PCR前引物進(jìn)行5′端加磷修飾或?qū)?/span>PCR產(chǎn)物磷酸化處理后再直接克隆于平滑末端的載體中。

2、將產(chǎn)物3′末端加A后再與T載體連接。
由于Fast Pfu DNA聚合酶的校對活性可引起引物從3′端被部分降解。因此在設(shè)計(jì)引物時應(yīng)適當(dāng)增加引物的長度，理想的引物長度為20-30bp 堿基。另外為了減少由3′- 5′外切酶活性引起的引物降解，盡量在冰上配制反應(yīng)體系。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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