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Hot Start Taq DNA Polymerase品是抗Taq單克隆抗體修飾的熱啟動(dòng)Taq DNA Polymerase，高溫加熱前抗Taq單克隆抗體與 Taq酶結(jié)合，抑制聚合酶的活性，從而抑制低溫條件下由引物的非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增?？?/span>Taq單克隆抗體在PCR反應(yīng)初的DNA變性步驟已變性，因此無需特殊失活處理，在常規(guī)PCR反應(yīng)條件下即可使用。在qPCR反應(yīng)中，能明顯提高熒光PCR的擴(kuò)增效率(尤其對(duì)低拷貝數(shù)模板)，改善其擴(kuò)增曲線的度，其穩(wěn)定性好、可重復(fù)性高、特異性。此酶室溫放置一周，酶活性仍可保持95%以上。

活性定義：1單位(U) Taq DNA Polymerase活力定義為在74℃，30分鐘內(nèi)，以活性化的大馬哈魚DNA作為模板，將10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質(zhì)所需的酶量。

質(zhì)量控制：SDS-PAGE檢測(cè)Taq DNA Polymerase純度大于99%;經(jīng)檢測(cè)無外源核酸酶活性;PCR方法檢測(cè)無宿主殘余DNA;能有效地?cái)U(kuò)增人類基因組中的單拷貝基因;室溫存放一周，無明顯活性改變。

酶貯存緩沖液：20mM Tris-HCl (pH 8.0);0.1 mM EDTA;1 mM DTT;100 mM KCl;50% glycerol;穩(wěn)定劑

適用范圍：用于小于6kb的對(duì)保真度要求不高的DNA片段的PCR擴(kuò)增、DNA標(biāo)記、引物延伸、序列測(cè)定、平末端加A等，產(chǎn)物可以直接用于T/A載體克隆。

建議PCR條件：預(yù)變性溫度是95度，時(shí)間為5-10分鐘，其它的和普通Taq酶的反應(yīng)條件一樣。
儲(chǔ)存條件：-20℃保存, 有效期至少一年

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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