產(chǎn)品目錄

本品是一步法RT-PCR反應(yīng)的專用試劑，反應(yīng)過程在同一管內(nèi)連續(xù)進行，避免開管，能有效防止污染。本品含有高溫反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)和新型熱啟動酶，采用優(yōu)化配方的專用Buffer，具有更高的反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增效率，適合于低濃度RNA模板的高靈敏度擴增。

25×One Step RTase mix

5×One Step RT Mix Buffer

本品先采用反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成 cDNA，然后再以合成的cDNA為模板，經(jīng)過PCR擴增反應(yīng)的熱變性、引物退火、鏈延伸三個步驟循環(huán)往復(fù)，在短時間內(nèi)擴增得到大量DNA片段，擴增得到的目的產(chǎn)物3’末端含有一個A堿基，可直接用于T/A克隆。

技術(shù)說明：

1、該體系常用50℃進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可以在45℃~60℃范圍內(nèi)進行反轉(zhuǎn)錄溫度優(yōu)化;根據(jù)反應(yīng)特征不同，可以在10~30分鐘內(nèi)對反轉(zhuǎn)錄時間進行優(yōu)化;

2、該體系所用的反轉(zhuǎn)錄酶是在MMLV基礎(chǔ)上進行了基因改造，去除了RNaseH活性，使其具有更高的溫度耐受性和反轉(zhuǎn)錄溫度，對RNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)模板具有更高的反轉(zhuǎn)錄效率;

3、該體系具有更好的體系穩(wěn)定性和適用性，非常適合于病毒、組織等樣本提取RNA復(fù)雜模板的檢測。
儲存條件：-20℃，避免反復(fù)凍融，有效期一年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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