產(chǎn)品目錄

Reverse Transcriptase（代耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶）是Reverse Transcriptase（代耐熱逆轉(zhuǎn)錄）的升級(jí)產(chǎn)品，是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基礎(chǔ)上通過體外分子進(jìn)化技術(shù)獲得的全新耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶。與上一代相比，進(jìn)一步大幅提高了熱穩(wěn)定性，50℃下半衰期過240min，并長(zhǎng)時(shí)間耐受55℃高溫且保持穩(wěn)定，非常適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。此外，增加了多個(gè)突變位點(diǎn)，進(jìn)一步增了模板親和力和行進(jìn)性，大幅提升全長(zhǎng)cDNA的合成能力，可獲得長(zhǎng)達(dá)20 kb的cDNA。另外，對(duì)于常見的逆轉(zhuǎn)錄抑制物具有更高的耐受度，非常適合于植物組織RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

活性定義：以Poly(rA) Oligo(dT)為模板/引物，在37℃，10min內(nèi)，摻入1 nmol的dTTP為酸不性溶物質(zhì)所需要酶量定義為1個(gè)活性單位（U）。

質(zhì)量控制

核酸外切酶殘留檢測(cè)：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 oC下孵育1h，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。

核酸內(nèi)切酶殘留檢測(cè)：200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在37 oC下孵育1h，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。

RNase殘留檢測(cè)：200 U本品和1 μg小鼠總RNA在37 oC下孵育1h，RNA電泳譜帶不發(fā)生變化。

功能檢測(cè)1：逆轉(zhuǎn)錄體系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA為模板，Oligo(dT)23為引物，50 oC反應(yīng)30min。取10% cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增β-actin基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見有單一的550 bp條帶。

功能檢測(cè)2：逆轉(zhuǎn)錄體系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA為模板，Oligo(dT)23為引物，55 oC反應(yīng)45min。取10% cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Polε基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見有單一的4.8 kb (GC-rich)條帶。
功能檢測(cè)3：逆轉(zhuǎn)錄體系中加入200 U本品，以1 pg-1 μg Hela cell total RNA為模板，Oligo(dT)23VN和Random Hexamers為引物，測(cè)試qRT-PCR 性能。以6個(gè)數(shù)量級(jí)的模板量的對(duì)數(shù)值對(duì)Ct值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之間。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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