產(chǎn)品目錄

本品是采用SYBR Green I嵌合熒光法進行Real Time PCR的專用試劑。已經(jīng)將熱啟動HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊穩(wěn)定劑、優(yōu)化的反應緩沖液、BSA和SYBR Green I等試劑預混成一種適合Real Time PCR反應檢測用2×Premix Type試劑，具有靈敏度高、特異性、穩(wěn)定性好等特點。

使用時只需加入模板和引物和水，便可在寬廣的定量區(qū)域內得到良好的標準曲線，對目的基因進行準確定量檢測，重復性好，可信度高。本品采用全新的Hotmaster Taq DNA 聚合酶，該酶不同于一般Hot-start 酶之處在于，一般的Hot-start 酶只在步溫度升高之前封閉酶的活性，而Hotmaster Taq DNA 聚合酶是利用抑制劑通過溫度調節(jié)方式封閉Hotmaster Taq DNA聚合酶的底物結合位點，溫度低于40℃時，形成非活性的酶-抑制劑復合物，當溫度升高至引物特異性的退火溫度時，結合平衡向模板-特異性引物復合物形成方向移動，因此大限度的減少PCR擴增全程中的非特異性擴增產(chǎn)物產(chǎn)生，大大提高了熒光定量PCR反應的精確性。

試劑盒組分(50次)：

2×SYBR qPCR Mix————————1.25ml

100×ROX參比染料————————25μl

注意事項：

1. 本制品含獨立參比染料ROX，客戶并根據(jù)qPCR儀器技術指導決定是否需要加ROX參比染料，用于消除信號本底以及校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號誤差。

2. 本制品含SYBR Green I 光下易分解，降低敏感度，使用時避免長時間光照射本制品。

3. 建議在冰上配制PCR反應液，再放入PCR儀器中擴增?？梢蕴岣邤U增特異性，減少背景。

4. 本制品含有4 mM MgCl2（反應體系終濃度是2 mM Mg2+），可用25mM MgCl2 優(yōu)化Mg2+濃度。
儲存條件：-20℃，有效期半年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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