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長片段DNA超速PCR MasterMix

  • 產(chǎn)品貨號：CS-01F97135
  • 產(chǎn)品價格：電議
  • 產(chǎn)品產(chǎn)地：國產(chǎn)
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：195
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：1ml|5ml
  • 品牌名稱:莼試
  • 分子式：
  • 分子量：

簡介內(nèi)容：長片段DNA超速PCR MasterMix現(xiàn)貨供應(yīng)，價格實惠。

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標簽:長片段DNA超速PCR MasterMix 1ml 5ml 

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產(chǎn)品屬性： 

產(chǎn)品名稱

英文名稱

規(guī)格

貨號

長片段DNA超速PCR MasterMix

Fast & Long DNA PCR MasterMix

1ml|5ml

CS-01F97135

本品包含速長片段DNA聚合酶、dNTPs和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，濃度為2×。使用時只需加入模板、引物，并補足水至Mix終濃度為1×即可。本制品含紅色示蹤染料，不需添加上樣緩沖液即可直接上樣進行電泳；也可經(jīng)過純化處理，以用于酶切、連接、熒光測序等后續(xù)操作。

產(chǎn)品特點：

1.快的擴增速度：延伸速度可以達到5～10秒/kb，短半小時完成PCR。

2.突出的長片段擴增能力：可以擴增高達10kb的長片段（包括人類基因組此類的復(fù)雜模板）。

3.良好保真性：保真度是taq的3～6倍以上。

4.大擴增能力：產(chǎn)量高，對于一些有特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)雜模板和GC含量高模板有良好效果。

注意事項：

1.本系統(tǒng)擴增速度極快，短片段或者簡單模板如質(zhì)粒模板可以嘗試5秒/kb延伸速度并采用較少循環(huán)數(shù)以進一步縮短PCR時間。長片段(≥3kb)或者復(fù)雜模板產(chǎn)量較低可以采用15-20秒/kb延伸速度或者采用較多循環(huán)數(shù)。

2.本品產(chǎn)量較低時可嘗試采用較長的延伸時間(如20秒/kb）和循環(huán)數(shù)（如35個）可以提高PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。

3.對于GC含量很高的模板，短片段預(yù)變性和變性溫度可以提高到98℃和/或適當(dāng)延長變性時間。長片段為了避免DNA損傷不應(yīng)該提高變性溫度，應(yīng)該適當(dāng)延長預(yù)變性時間到5分鐘，變性時間可以適當(dāng)提高5-10秒。

4.如果擴增模板GC含量高或者模板復(fù)雜擴增效果不佳時，可在反應(yīng)混合物中加入DMSO到終濃度1%-8%，按照1%梯度增加摸索佳濃度。或者加入甜菜堿至終濃度1～1.7M。并采用降落PCR（Touchdown PCR）
儲存條件：-20℃，有效期2年。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量
(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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