產(chǎn)品目錄

本品是由Babuddy Super Fidelity DNA Polymerase、PCRBuffer、Mg2+、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增劑組成的預(yù)混體系，濃度為2×。Babuddy Super Fidelity DNA Polymerase是一種快速、高擴增效率的高保真DNA聚合酶，具有5'-3'DNA聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性。經(jīng)過改造的聚合酶其活性區(qū)域融合有一段聚合增結(jié)構(gòu)域，獨特的結(jié)構(gòu)極大提升了保真性和延伸速度。Babuddy Super Fidelity DNA Polymerase的保真性是普通Taq DNA Polymerase的50倍，是普通Pfu的6倍。其延伸速率為15-30s/kb，成功克服了普通Pfu酶擴增效率低、擴增速度慢的缺陷，大大縮短了反應(yīng)時間。

本品特別適合于在基因克隆實驗中擴增長片段DNA，尤其在擴增>10 kb的DNA片段時，優(yōu)勢更加明顯，所擴增的片段長可達(dá)20 kb。預(yù)配好的PCR混合液使操作更加簡單快捷，可大限度地減少人為誤差和污染。

使用本產(chǎn)品擴增得到的PCR產(chǎn)物的3'端不帶有“A”堿基，可直接克隆于平末端載體中。如需進(jìn)行T/A克隆，需在PCR產(chǎn)物末端添加“A”后進(jìn)行克隆。本產(chǎn)品具有延伸速度快、擴增效率高、保真性的特點。適用于基因克隆、基因定點突變、SNP等實驗。本產(chǎn)品已加入染料(藍(lán)色)，反應(yīng)結(jié)束后可直接進(jìn)行電泳檢測，無需再使用上樣緩沖液。

產(chǎn)品特點：

1、高保真性：保真性是普通Taq DNA Polymerase的50倍，普通Pfu的6倍。

2、擴增速度快：其延伸速率為15-30sec/kb，成功克服了普通Pfu酶擴增效率低、擴增速度慢的缺陷。

3、特別適合于擴增長片段：擴增的片段長度可長達(dá)20kb。
儲存條件：-20℃，避免反復(fù)凍融。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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