產(chǎn)品目錄

本試劑盒是以分子流行病學(xué)新研究進(jìn)展為基礎(chǔ)，經(jīng)工藝優(yōu)化后形成的人型結(jié)核分枝桿菌基因分型產(chǎn)品。本產(chǎn)品利用結(jié)核分枝桿菌基因組中可發(fā)數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable-number tandem repeats,VNTR）多態(tài)性進(jìn)行基因型分型區(qū)分臨床菌株，是研究結(jié)核分枝桿菌分子流行病學(xué)和監(jiān)測結(jié)核病傳播狀況的有力工具。不現(xiàn)有其它基于VNTR原理的結(jié)核分枝桿菌VNTR分型系統(tǒng)相比，這一分型系統(tǒng)對(duì)中國流行的菌株具有更的分辨能力，因此特別適合于中國用戶的需求。

通過對(duì)各PCR反應(yīng)引物序列和預(yù)混反應(yīng)液成份進(jìn)行精心優(yōu)化，使得本試劑盒具有很的抗干擾力。不用戶自配試劑相比，本產(chǎn)品顯著提升了特異條帶信號(hào)度，降低了使用粗制模板（煮沸菌液）時(shí)非特異條帶的出現(xiàn)率，使實(shí)驗(yàn)操作更加簡便、快捷的同時(shí)，提高了檢測成功率。本產(chǎn)品的預(yù)混反應(yīng)液化學(xué)穩(wěn)定性良好，能有效抵抗反復(fù)凍融（10次）和較長時(shí)間（一周）的室溫環(huán)境，更好地適應(yīng)了用戶檢測工作中的靈活性需求。

本試劑盒將人型結(jié)核分枝桿菌（MTBC）鑒定、非結(jié)核分枝桿菌（MOTT）及模板質(zhì)量鑒定、結(jié)核分枝桿菌北京家族菌株鑒定，和后續(xù)的9位點(diǎn)VNTR分型鑒定整合在一個(gè)試劑盒中，使用戶僅需一個(gè)試劑盒、12個(gè)PCR反應(yīng)即可獲得待測菌株基因型鑒定所需的完整信息。檢測的分辨力指數(shù)（Hunter-Gaston index，HGI）可達(dá)0.989。并且，基因型鑒定結(jié)果可數(shù)字化記錄，使得不同批次樣本，不同地區(qū)，不同時(shí)間，不同研究者之間的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以很方便地進(jìn)行比對(duì)和匯集分析，極大地提高了數(shù)據(jù)的使用效率。

對(duì)鑒定為VNTR-9基因型成簇（所有9個(gè)位點(diǎn)具有相同重復(fù)數(shù)）的樣本，若要判定菌株間是否存在近期傳播關(guān)系，需使用配套產(chǎn)品TB基因分型試劑盒HV-3，做進(jìn)一步的分型鑒定。VNTR-9不HV-3兩個(gè)產(chǎn)品的結(jié)合使用可將檢測的HGI提升至0.993。關(guān)于TB基因分型試劑盒HV-3產(chǎn)品的更多信息請見其產(chǎn)品說明書。
保存：-20℃保存一年

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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