產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱(chēng)	英文名稱(chēng)	規(guī)格	貨號(hào)
活細(xì)胞示蹤劑CMFDA(綠色)	CellTracker Green CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	50μg\|2×50μg\|5×50μg	CS-01F97011

MFDA，英文全稱(chēng)5-chloromethylfluorescein diacetate，是一種可自由透過(guò)活細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞進(jìn)行示蹤的熒光染料。

CMFDA是二乙酸熒光素（Fluorescein diacetate，FDA）的氯甲基衍生物，具細(xì)胞膜滲透性，無(wú)色，不具有熒光發(fā)光性。當(dāng)通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞后，CMFDA中的親脂性基團(tuán)可被胞漿內(nèi)非特異性酯酶水解，生成5-氯甲基熒光素（5-chloromethylfluorescein）；5-氯甲基熒光素可發(fā)出綠色熒光，因帶電荷而不能自由穿透細(xì)胞膜，并利用自身氯甲基與細(xì)胞內(nèi)蛋白和多肽中的在巰基轉(zhuǎn)移酶作用下生成加合物，能完好的保留在胞內(nèi)。經(jīng)CMFDA標(biāo)記的細(xì)胞，熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標(biāo)記的時(shí)間可達(dá)數(shù)天（至少3天），因此非常適用于細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生等研究。與常用的鈣黃綠素和FDA相比，具有較長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)保留特點(diǎn)。

在細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中，CMFDA標(biāo)記熒光可分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，且具有不會(huì)使鄰近細(xì)胞染色的功能（有極少情況下通過(guò)細(xì)胞間縫隙連接發(fā)生染色）。同時(shí)，CMFDA標(biāo)記熒光還主要用于分析細(xì)胞間融合、細(xì)胞粘附及多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究。此外，CMFDA還可用于與其他細(xì)胞示蹤染料聯(lián)合選擇性標(biāo)記感染細(xì)胞內(nèi)的病原菌；與膜不通透性核熒光探針共同使用，可用于細(xì)胞活性研究。
本品具有細(xì)胞示蹤試劑理想的特性：穩(wěn)定、無(wú)毒（工作濃度范圍內(nèi)）、細(xì)胞內(nèi)熒光保留性好、熒光（生理pH范圍內(nèi)）。CMFDA標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，Ex=492nm，Em=517nm，可與其他顏色熒光染料，如紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP）等共染。本品以粉末形式提供，需用DMSO制備儲(chǔ)存液后再使用。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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