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本品為iFluor 488標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，可發(fā)出高亮度、光穩(wěn)定的綠色熒光，染色反應(yīng)特異性，對(duì)比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測(cè)。iFluor 488 鬼筆環(huán)肽染色與用于細(xì)胞分析的其他熒光染色完全兼容，包括熒光蛋白、納米晶體和其他iFluor偶聯(lián)物（包含iFluor偶聯(lián)二抗）。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。本品以1000×儲(chǔ)存液形式（溶于DMSO）提供。

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結(jié)合于絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin，而不會(huì)與單體肌動(dòng)蛋白G-actin結(jié)合，通常用來標(biāo)記組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體系中的F-actin，從而對(duì)F-actin進(jìn)行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無論是動(dòng)植物來源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞，按照每一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基約與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的計(jì)量比結(jié)合。且非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識(shí)度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動(dòng)蛋白（Actin）抗體進(jìn)行相關(guān)研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15?，分子量＜2000 Daltons，未標(biāo)記肌動(dòng)蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發(fā)生反應(yīng)；鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標(biāo)記后仍可收縮等。

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動(dòng)蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1μg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

分子量：～1900

大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：493/517nm

溶解性：溶于DMSO
儲(chǔ)存條件：-20℃避光干燥，有效期一年

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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