產(chǎn)品目錄

本品是無菌的即用型PI染色液（溶于PBS），可進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，并被活細(xì)胞排斥在外，適合用于流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞活力分析。PI單染用FL2通道檢測，若與FITC或PE標(biāo)記抗體/蛋白聯(lián)合使用FL3通道檢測。

碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一種常用的細(xì)胞核熒光染料，作為一種溴化乙錠（EB）的類似物，能夠嵌入堿基對之間實(shí)現(xiàn)與雙鏈DNA結(jié)合。PI經(jīng)488 nm熒光激發(fā)，產(chǎn)生相對較大的斯托克司頻移后，并在617 nm處具有大發(fā)射波長。另外，PI不能穿透細(xì)胞膜而被排斥在活細(xì)胞外，但是可以穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色。利用以上特性，PI可作為細(xì)胞活力分析的熒光探針之一。不僅可單獨(dú)使用；也可以同Calcein-AM、Hoechst 33258或Hoechst 33342等活細(xì)胞熒光探針一起使用，同時(shí)對活細(xì)胞和死細(xì)胞染色和鑒定。也能夠與488 nm激發(fā)的熒光素如FITC和PE等聯(lián)合使用。

使用方法

1）收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，高以1 x 106 cells/100 μl的量加入FACS分選管；

2）加2ml PBS（或HBSS）清洗細(xì)胞，300 x g離心5 min，去上清。重復(fù)一次。

注：若需要用抗體標(biāo)記表面抗原，可在此步之后進(jìn)行。PI不適合與檢測胞內(nèi)分子的抗體聯(lián)合使用。

3）細(xì)胞清洗后，用100 μl流式細(xì)胞染色緩沖液（flow cytometry staining buffer）重懸細(xì)胞；加入10 μl PI染色液，輕柔混勻，冰上或者室溫避光孵育10-15 min。

4）直接上機(jī)進(jìn)行流式分析。注：PI染色后不可再清洗細(xì)胞。PI染色孵育后盡快上機(jī)檢測。

注意事項(xiàng)

1）碘化丙啶（PI）是已知的誘變劑，操作過程中一定要做好防護(hù)工作避免與PI的直接接觸。另外PI溶液在丟棄之前需要先經(jīng)過活性炭處理。

2）流式細(xì)胞染色緩沖液可配制如下：1×PBS (w/o Ca2+ and Mg2+) + 0.5-1% BSA（或 5% FBS）＋0.1% 疊氮鈉。也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身體系調(diào)整。

3）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
儲存條件：4℃，有效期半年

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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