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Fluo-3成像涉及到鈣離子信號通路的多個方面，Fluo-3經(jīng)常應(yīng)用在流式細胞術(shù)上，如螯合劑光活化、信使、神經(jīng)遞質(zhì)以及細胞水平的藥理篩選。Fluo-3在這些應(yīng)用里之所以能大量運用主要是由于其幾個重要特性：Fluo-3可以被氬離子激光器488nm激發(fā)，并在與Ca2+結(jié)合后，發(fā)射熒光很明亮的熒光信號。Fluo-4是Fluo-3以兩個氟原子取代氯原子的類似物，這一微小的結(jié)構(gòu)變化使得Fluo-4探針在488nm激發(fā)光下的熒光信號得到增，信號穩(wěn)定持續(xù)，可以應(yīng)用于共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、微孔板讀數(shù)儀。

Fluo-2、Fluo-3和Fluo-4在與Ca2+結(jié)合后熒光增，與紫外激發(fā)的探針fura-2和indo-1不同，不會發(fā)生光譜漂移。熒光光密度在與Ca2+結(jié)合后，增至少100倍。

加載細胞說明

加載細胞，建議使用膜透性的AM酯類形式的探針，如下操作建議僅供參考。

使用前將染料用無水DMSO溶解制成染料的DMSO儲液（2～5mM，Fluo-8 MW:1046.93），再用合適培養(yǎng)基稀釋一份染料的DMSO儲液（2～5mM）到1～10μM的終濃度，加入非離子型去污劑Pluronic F-127可以協(xié)助非極性的AM酯在水溶液中的擴散?？梢院唵蔚耐ㄟ^先等體積混合20%（w/V）的Pluronic與DMSO，確保Pluronic在加載到細胞中的工作濃度是0.02%。

有機陰離子轉(zhuǎn)運抑制劑probenecid（1～2.5mM）或sulfinpyrazone (0.1～0.25mM)可以添加到細胞培養(yǎng)基中，以減少探針在胞脫酯現(xiàn)象。外的Probenecid和sulfinpyrazone儲液基本為堿性，因此在添加到培養(yǎng)基中時需要先調(diào)整到與所用培養(yǎng)基匹配的pH。

細胞通常可以與AM酯探針在20～37℃條件下孵育20～60分鐘，佳的探針加載濃度、時長與溫度需要在實驗中具體摸索確定。一般來說為了減少可能的毒性負荷，只要滿足足夠的熒光檢測度，選擇盡可能低的染料濃度。此外，由于亞細胞結(jié)構(gòu)的分區(qū)化特點，AM酯加載技術(shù)存在固有的標記問題，這可以通過降低孵育溫度來解決。
在進行熒光檢測之前，細胞應(yīng)用無指示劑的培養(yǎng)基（允許的話，可以添加陰離子轉(zhuǎn)運抑制劑）充分洗滌，以確保洗去細胞表面的非特異性染料吸附，再另外以新鮮培養(yǎng)基孵育30分鐘保證胞內(nèi)酯酶水解充分進行。這里，可能會有少量的指示劑逸出胞外從而產(chǎn)生背景熒光，可以通過臨將上機檢測之前，在外培養(yǎng)基中添加抗熒光素抗體，來降低背景。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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