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MEQ（MQAE）是一個(gè)6-甲氧基花青苷衍生物，是細(xì)胞內(nèi)的Cl-熒光指示劑，該染料可以通過(guò)受被動(dòng)擴(kuò)散所控制的碰撞淬滅來(lái)檢測(cè)離子濃度。目前，檢測(cè)Cl-所用熒光染料主要是MQAE 和SPQ，MQAE 相比SPQ 來(lái)說(shuō)對(duì)于Cl-的濃度有更高的靈敏度和更高的熒光量子比率。

MQAE 的工作液可以配制于Krebs-HEPES 緩沖液中。Krebs-HEPES 緩沖液即為20mM HEPES，128mM NaCl，2.5mM KCl，2.7mMCaCl2，1mM MgCl2，16mM glucose，pH7.4。MQAE 標(biāo)記細(xì)胞時(shí)的濃度通常為5-10mM。以約800-1000 萬(wàn)細(xì)胞每毫升的細(xì)胞密度，在含有5-10mM MQAE 的Krebs-HEPES 緩沖液中孵育30-60 分鐘。通常一個(gè)探針的裝載體系為100 微升即可。隨后用Krebs-HEPES緩沖液或其它適當(dāng)溶液洗滌5 次左右，即可進(jìn)行相應(yīng)熒光測(cè)定。詳細(xì)的使用方法請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn)。以下對(duì)胞內(nèi)氯離子的熒光測(cè)量[Cl-]做簡(jiǎn)要說(shuō)明計(jì)算。Stem-Volmer 方程可以給出氯離子探針的熒光度與氯離子濃度的關(guān)系：

(FO/F) – 1 = KSV[Q]

FO 是沒(méi)有鹵化物或其他淬滅離子時(shí)的熒光度，F 是有淬滅劑時(shí)的熒光度，[Q]是淬滅劑濃度，而KSV 是Stem-Volmer 方程常數(shù)。建議對(duì)實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行校準(zhǔn)，以得到研究用細(xì)胞類型的指示劑探針的Ksv，利用線性回歸模型分析Stem-Volmer 方程。Stem-Volmer 方程中的氯離子Ksv 常數(shù)可以隨著碰撞淬滅的陰離子物質(zhì)的增多而明顯降低，如多肽。便于校準(zhǔn)，可以固定胞內(nèi)氯離子的濃度，通過(guò)使用雙三丁基氧化錫和尼日利亞菌素10~30μM。為了保證滲透壓好使用陰離子不淬滅染料，取代氯離子，如葡萄糖酸。
儲(chǔ)存：-20℃，避光，有效期6個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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