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Na+敏感型染料,SBFI 和K+敏感型染料,PBFI，是鈉鉀離子濃度測(cè)定時(shí)所用到的選擇性熒光指示劑。這類(lèi)苯并呋喃間苯二甲酸酯的衍生物以及其具有膜透性的乙酰氧基甲基酯形式（AM 酯）可以在生理?xiàng)l件（含多種其他一價(jià)陽(yáng)離子）下，給予鈉鉀離子濃度以上時(shí)間及空間上準(zhǔn)確的變化測(cè)量精度。

此外，這類(lèi)染料的激光光譜可以選擇用與Fura-2 類(lèi)似的濾光器與檢測(cè)儀。.這些鈉鉀探針指示劑由熒光團(tuán)與氮冠醚成環(huán)狀連接，賦予各自的配位體選擇性。在pH7，且Na 或K 離子缺失的情況下，SBFI 和PBFI 的消光系數(shù)大約在42,000 cm-1M-1（346 nm）。一旦與離子結(jié)合，其激發(fā)峰顯著收窄，大激發(fā)峰向短波段偏移，光能量吸收比值變?yōu)?/span>340nm/380nm。SBFI 結(jié)合Na離子之后熒光度約增2.5 倍，但發(fā)射光譜大值基本不變。pH6.5～7.5，這類(lèi)熒光素的光譜特性基本維持不變，相比較而言，離子濃度和粘度對(duì)其影響更大。

雖然這類(lèi)離子指示劑有相當(dāng)?shù)倪x擇性，但對(duì)于Na 離子親和的SBFI 來(lái)說(shuō)K 離子同樣有一定的影響，PBFI 也是如此。在K 離子生理濃度下，SBFI 對(duì)于Na 的Kd 值為11.3mM，而沒(méi)有K 離子存在時(shí)，則為3.8mM。SBFI 對(duì)Na 的選擇性比K 要高出18 倍。

同樣地，PBFI 對(duì)K 離子的解離常數(shù)也烈地依賴(lài)于Na 的存在。Na 的是否存在，使得PBFI 對(duì)于K 離子的Kd 從100mM 到10mM不等。雖然PBFI 對(duì)于K 離子的選擇性?xún)H僅高出Na 的1.5 倍，但在細(xì)胞的生理?xiàng)l件下，通常K 離子的濃度要高于Na 的10 倍以上。所以，在胞內(nèi)加載探針時(shí)，這些探針的Kd 值應(yīng)與適當(dāng)?shù)妮d體做校準(zhǔn)。

用無(wú)水DMSO 制備PBFI AM 酯類(lèi)的儲(chǔ)液，濃度為10mM。PBFI AM 的相對(duì)分子量為1171.由于這類(lèi)AM 酯形式的探針?biāo)苄员容^差，建議溶解時(shí)，使用必要的Pluronic F-127.通?？梢栽谶M(jìn)行加載探針到細(xì)胞之前，將探針的DMSO 溶液與等體積25%（w/V）的PluronicF-127 混合。探針加載濃度范圍：5μM～10μM，孵育時(shí)間40 分鐘~4 小時(shí)。具體的加載條件好能參考相關(guān)文獻(xiàn)或者實(shí)驗(yàn)摸索，因?yàn)樵撎结樤诓煌募?xì)胞內(nèi)的Kd 值不同。校準(zhǔn)細(xì)胞內(nèi)PBFI 使用K+離子載體纈氨酶素。
一般來(lái)說(shuō)，這些指示探針可以用340nm 激發(fā)光激發(fā)，但在380nm 熒光對(duì)于目的離子的濃度尤其敏感。發(fā)射峰的檢測(cè)可以設(shè)置在500nm，計(jì)算Na+ K+的濃度。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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