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采用瓊脂糖電泳檢測雙鏈DNA時，SYBR GreenⅠ是靈敏的熒光染料，當其結(jié)合到核酸上時，會產(chǎn)生很的熒光及高量子產(chǎn)額，DNA/SYBR GreenⅠ復(fù)合物的量子產(chǎn)額均為0.8。由于與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很的信號，背景極低，并且對核酸的親和力高，因此SYBR染料可在低濃度條件下使用。SYBR GreenⅠ的低檢出限：20pg DNA(254nm);60pg DNA(300nm紫外透射)；此外，SYBR GreenⅠ還可以用于檢測寡核苷酸(1～2ng,300nm紫外透射)，比EB靈敏20至100倍。SYBR GreenⅠ用于電泳檢測DNA時，既可預(yù)染，也可電泳后再進行染色。SYBR GreenⅠ用于瓊脂糖電泳檢測DNA后，可直接將DNA轉(zhuǎn)移至膜上，進行后續(xù)核酸印跡雜交反應(yīng)。此外，SYBR GreenⅠ與DNA的結(jié)合對多種常用的限制性內(nèi)切酶活性無抑制作用，可直接進行消化或連接。

使用說明：

點染法：用于瓊脂糖凝膠電泳：取原液1μl加入TE緩沖液或滅菌雙蒸水1ml，再加入6×DNA Loading buffer上樣緩沖液1ml混勻，(此時溶液為1:2000稀釋，即為工作液)電泳時取1～2μl工作液和5μl電泳樣品混勻后靜置5min后直接上樣。

膠染法：常規(guī)配置瓊脂糖凝膠100ml，加熱至融化，待溫度將至50～70℃（感覺不燙手）加入該原液10μl。待膠凝固后即可電泳，電泳結(jié)束后即可在紫外照射下觀察。

注意事項：

1.SYBR GreenⅠ應(yīng)避光存放，原液保存于-20℃；建議分裝凍存，短期可以4℃保存。

2.膠染法靈敏度較高，須將商品化的DNA marker稀釋5～10倍后使用。

3.在預(yù)染色方法中，電泳時間不要過2小時，否則SYBR GreenⅠ會從DNA上分離出來，會產(chǎn)生彌散狀條帶。

4.在常規(guī)用酒精沉淀核酸的過程中，SYBR Green I可以全部從雙鏈核酸上去掉。

5.在紫外照射透視下，與雙鏈DNA接合的SYBR Green I呈現(xiàn)綠色熒光。如果膠中含有單鏈DNA則顏色為橘黃而不是綠色。

6.SYBR Green對玻璃和非聚丙烯材料具有一定親合力。建議在稀釋、貯存、染色等使用過程中用聚丙烯類容器。
儲存條件：-20℃避光保存，有效期12個月。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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