產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
快速實時熒光定量PCR預(yù)混體系(高含量ROX校正染料)	BaFaSYBR Mixture(High ROX)	5ml	CS-01F99187

本品是專用于染料法(SYBR GreenⅠ)實時熒光定量PCR的預(yù)混體系，濃度為2×,包含Fast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I熒光染料和Mg2+，操作簡單方便。主要用于基因組DNA靶序列和RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA靶序列檢測。本品所含熒光染料SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，使該產(chǎn)品可用于不同靶序列的檢測而不需合成特異性標記探針。本品含有的Fast Taq DNA Polymerase能有效減少在常溫條件下由引物和模板非特異性結(jié)合或引物二聚體而產(chǎn)生的非特異性擴增，酶的激活僅需在95℃孵育20s。整個PCR反應(yīng)過程比普通反應(yīng)可節(jié)省約40分鐘，大大縮短了PCR的反應(yīng)時間。獨特的PCR緩沖體系與熱啟動酶的組合，有效抑制了非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，并顯著提高PCR的擴增效率。該產(chǎn)品應(yīng)用范圍廣，適用于普通和快速定量PCR程序，可適用于無需ROX校正的所有熒光定量PCR儀。

注意：

1)本產(chǎn)品所采用的酶須在預(yù)變性95℃、20s條件下實現(xiàn)酶的活化。在此條件下，大多數(shù)模板可良好的進行解鏈。對GC含量高、二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的模板，可將預(yù)變性時間延長至1分鐘，以使起始模板充分解鏈。若高溫處理時間過長，會對酶的活性造成影響。可根據(jù)模板情況確定最佳的預(yù)變性時間。

2)建議采用兩步法PCR反應(yīng)程序，退火溫度請以60-64℃作為設(shè)定范圍的參考，發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可提高退火溫度。若因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結(jié)果時，可嘗試進行三步法PCR擴增，退火溫度請以 56℃-64℃的范圍作為設(shè)定參考。

3)融解曲線分析請以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進行設(shè)定，本程序是以ABI 7500熒光定量PCR儀為參照設(shè)定。
儲存條件：-20℃，避免反復(fù)凍融

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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