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瓊脂糖（Agarose）是純化的線性半乳聚糖親水膠體，提取自瓊脂或者含瓊脂的海藻，結(jié)構(gòu)上是一種線性聚合物，由β-D-吡喃半乳糖（1-4）連接3,6-脫水α-L-吡喃半乳糖基構(gòu)成。作為一種凝膠試劑，常用于通過凝膠電泳或者印跡法（如Northern或Southern）來進(jìn)行日常核酸分析，也適用于蛋白應(yīng)用，如輻射狀免疫擴(kuò)散（RID）實(shí)驗(yàn)。

本品為PCR級高分辨率瓊脂糖，對PCR產(chǎn)物、小片段DNA具有較高的分辨率，適宜分離20bp-800bp的DNA片段，其分離效果可與聚丙烯酰胺相媲美。此外，還具有如下特點(diǎn)：

1）易溶解，膠液更清澈，可以配制高達(dá)5%的凝膠；

2）很低的背景；

3）品質(zhì)穩(wěn)定等。

使用方法

1）配制適量電泳及制膠用的緩沖液（根據(jù)電泳需要，配制合適濃度的電泳及制膠緩沖液），倒入合適三角瓶中?！咀⒁狻浚河糜陔娪镜木彌_液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。

2）根據(jù)制膠量及凝膠濃度，加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉（總液體量不宜過三角錐瓶的50%容量）。

3）在微波爐中加熱溶解瓊脂糖，設(shè)置中火加熱至沸騰，保持膠液沸騰約 30s，戴上防熱手套，移開三角錐瓶，小心搖動三角錐瓶，重懸未溶解顆粒，再次用高火加熱1分鐘（或加熱直至瓊脂糖完全溶解）。請戴上防熱手套，小心搖動三角錐瓶，使瓊脂糖膠液充分均勻。

【注意】：必須保證瓊脂糖充分完全溶解，此時瓊脂糖膠液清澈，否則，會造成電泳圖像模糊不清。加熱時如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時間不宜過長。

4）使溶液冷卻至60℃左右，如需要可在此時加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg/ml，并充分混勻。

【注意】：溴化乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴化乙錠的溶液時，請戴用手套。建議使用我司提供的EB無毒替代品（YeaRed 核酸染料，Cat# 10202），使用時僅需用制膠緩沖液稀釋至1×工作液即可。

5）將瓊脂糖溶液倒入制膠模具中，在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3-5mm之間。

6）在室溫下使膠凝固（大約30min-1h），然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。
【注意】：凝膠不立即使用時，請用保鮮膜將凝膠包好后在4℃下保存，一般可保存 2～5天。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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