產(chǎn)品目錄

本品通過pH中性緩沖液制備，丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺配比是29：1，其規(guī)格為濃縮膠5%，分離膠8%，膠板尺寸10×8cm，凝膠厚度1 mm，12孔梳齒，單孔最大上樣量30 µl。電泳及轉(zhuǎn)膜緩沖液使用傳統(tǒng)的tris-glycine緩沖液，蛋白條帶直且尖銳。本品兼容Biorad，天能及北京六一的mini膠電泳槽及其他任何膠板寬度在10 cm的電泳槽。

N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（甲叉丙烯酰胺）交聯(lián)劑的濃度不同從而分離不同大小范圍的蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)實驗室自行配制凝膠相比，使用預(yù)制膠具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）即開即用，不用再配制N種溶液、灌膠、等膠凝固，節(jié)省了寶貴的時間和精力；2）不用接觸幾種具有積累性神經(jīng)毒性的試劑（丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺：神經(jīng)毒性和遺傳毒性；TEMED：強(qiáng)神經(jīng)毒；過硫酸銨：可嚴(yán)重?fù)p傷呼吸道，眼睛，皮膚）；3）大規(guī)模生產(chǎn)，膠與膠之間重復(fù)性好，質(zhì)量穩(wěn)定，不像手工灌膠那樣結(jié)果差異大。

使用方法

1）剪開包裝取出膠，撕去膠板底端膠紙，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，加入電泳緩沖液沒過梳齒部位，雙手按住梳子左右部位將其平穩(wěn)緩慢（一定要慢，否則會將膠齒拔斷或拔歪）拔出，在前后板的上方中央卡上一個“V”型卡（通過加固前后板，不僅可防止槍頭上樣用力過猛撬開兩板產(chǎn)生縫隙，還可穩(wěn)定跑膠質(zhì)量，電泳過程中“V”型卡不可取出），上樣后進(jìn)行電泳，電泳后取出膠板，用鑷子或小螺絲刀沿左右兩板間的縫隙將兩板別開，將膠取出，棄去塑料板。

2）電泳：使用《分子克隆》指定的 tris-glycine電泳緩沖液（tris 25 mM, glycine 250 mM, SDS 0.1%）。推薦使用低壓100V，15min換高壓150V跑至電泳結(jié)束。
3）轉(zhuǎn)膜：使用《分子克隆》的 tris-glycine 電轉(zhuǎn)緩沖液（含 20%甲醇或乙醇），操作與實驗室原有操作完全相同。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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