產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(還原劑和螯合劑耐受型)	GoldBalb His-tag Protein Purification Kit	10ml	CS-01F99231

試劑盒是一種采用了新型的GoldBalb His-tag Purification Resin的可以兼容還原劑和螯合劑，并能簡單、快速、高效并且高特異性地純化His標(biāo)簽蛋白的試劑盒。試劑盒提供了His標(biāo)簽蛋白所需的相關(guān)試劑和親和層析柱空柱管（10套×3mL），為His標(biāo)簽蛋白的純化帶來了極大的便利。一個(gè)包裝的本產(chǎn)品足夠進(jìn)行10次His標(biāo)簽重組蛋白純化，每次細(xì)菌沉淀的濕重約為1克。每次蛋白的最大純化量為10～15mg，具體的最大純化量和蛋白分子量有關(guān)；對(duì)于分子量為50kD的帶有His標(biāo)簽重組蛋白，每次的蛋白最大純化量為3～10mg。在不使用親和層析柱空柱管的情況下，參考本說明書本試劑盒足夠進(jìn)行500次小量His標(biāo)簽蛋白純化。

蛋白樣品溶液通過GoldBalb His-tag Purification Resin時(shí)，重組蛋白His標(biāo)簽上的組氨酸殘基能特異性地結(jié)合到GoldBalb His-tag Purification Resin中的鎳離子上，其它蛋白則不能被結(jié)合。洗滌后，His標(biāo)簽重組蛋白可在非變性條件下被洗脫，從而被分離純化。

GoldBalb His-tag Purification Resin對(duì)His標(biāo)簽重組蛋白的親和力強(qiáng)、選擇性高、結(jié)合容量大，可以獲得高純度的His標(biāo)簽重組蛋白，可用于簡單、快速、高效地純化細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲及桿狀病毒等多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的His標(biāo)簽重組蛋白。純化的蛋白可以用于結(jié)構(gòu)和功能研究、抗體制備、蛋白與蛋白相互作用、蛋白與核酸相互作用等方面的研究。

GoldBalb His-tag Purification Resin采用了一種高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠(Sepharose CL-6B)為基質(zhì)，并使用了進(jìn)一步優(yōu)化的接臂和鎳離子螯合技術(shù)，和目前市售的大多數(shù)Ni-NTA agarose或類似產(chǎn)品相比，非特異性蛋白結(jié)合顯著降低，耐受壓力強(qiáng)，鎳離子螯合非常穩(wěn)定。和同類產(chǎn)品相比，本產(chǎn)品由于鎳離子基本不會(huì)流失，重復(fù)使用本純化介質(zhì)時(shí)不需要重新裝載鎳離子。

Ni-NTA agarose以及絕大多數(shù)類似的鎳柱產(chǎn)品不能耐受蛋白樣品中常見濃度的還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇等以及常見濃度的螯合劑如EDTA等，但GoldBalb His-tag Purification Resin可以很好地耐受DTT等還原劑以及EDTA等螯合劑。本產(chǎn)品可耐受20mMDTT等還原劑，以及20mMEDTA等螯合劑。這為需要添加還原劑或螯合劑的蛋白樣品的純化提供了可能性。本產(chǎn)品不兼容8M尿素和6M鹽酸胍。對(duì)于包涵體蛋白的純化，在采用8M尿素或6M鹽酸胍溶解蛋白的情況下，需要通過透析去除尿素和鹽酸胍后才能使用本產(chǎn)品進(jìn)行His標(biāo)簽蛋白的純化。
保存條件：4℃保存，至少一年有效。除GoldBalb His-tag Purification Resin外，其余均可以-20℃保存。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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