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產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
磁珠法石蠟包埋組織DNA提取試劑盒	FFPE DNA Extraction Kit with Magbead	96次	CS-01F99111

介紹

本試劑盒提供了一種簡單、快速、高效的從石蠟包埋組織中提取DNA的方法。實驗過程中可采取無毒的去蠟劑去除石蠟，降低實驗過程中對實驗者的危害。組織裂解后，DNA結(jié)合于硅基包被磁珠表面。漂洗后，高純度的DNA洗脫于EB或去離子水中。DNA的得率、片段大小與樣品類型，及儲存條件、時間有很大關(guān)系。提取得到的DNA可用于定量PCR、二代測序建庫等下游檢測。

保存條件：室溫（15-30℃）。

自備試劑：無水乙醇、異丙醇

實驗前準(zhǔn)備及重要注意事項：

1．向25 mg Proteinase K粉末中加入1.25 ml Proteinase K Storage Buffer，渦旋震蕩混勻使其充分溶解，之后-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2．第一次實驗前按照試劑瓶標(biāo)簽上的說明向Buffer GW1和Buffer GW2中加入指定用量的無水乙醇。

3．Magbeads PN嚴(yán)禁冰凍和高速離心，否則可能會對Magbeads PN造成不可逆的損害。

操作方法：

石蠟去除（方案一二甲苯法）

1．用刀片去除組織周圍多余石蠟，之后切取5-8片5-10μm的石蠟卷放入1.5 ml離心管中。

2．向離心管中加入1 ml二甲苯，渦旋震蕩10秒使石蠟充分溶解。

3．16,000×g離心2分鐘，之后吸棄溶液，小心沉淀丟失。

4．向離心管中加入1 ml無水乙醇，渦旋震蕩10秒。

5．16,000×g離心2分鐘，之后吸棄溶液，小心沉淀丟失。
6．打開管蓋，室溫放置10分鐘使乙醇充分揮發(fā)。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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