產(chǎn)品目錄

本試劑盒用于從植物葉片中分離出完整而純化的線粒體。適合于田間采摘或者實驗室培養(yǎng)的植物葉片中線粒體DNA的提取制備。線粒體DNA提取的關(guān)鍵是盡可能的去掉核DNA。本試劑盒利用差速離心得到比較純凈的線粒體，再利用DNA酶消化和裂解緩沖系統(tǒng)等多步驟去掉核DNA，最后得到純凈的線粒體DNA?？捎糜?/span>PCR等對純度要求較高的實驗。

保存條件：2～8℃一年，RNase A及DNase I -20℃保存。使用前，在DNase I中加入600μL(50T)或者1100μL(100T)的DNA酶反應(yīng)液，分裝后-20℃保存三個月，如果超過三個月，活性可能會降低，請自行訂購DNase I。線粒體裂解液使用前常溫保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影響使用。

操作步驟：

準備工作：在DNASE I中加入600μL(50T)或者1.1mL(100T)的DNA酶反應(yīng)液，適當分裝后-20℃保存。線粒體裂解液保存于常溫，如有沉淀37℃水浴溶解，離心機溫度下降到4℃(2～8℃)，如無低溫離心機，也可以常溫離心，并將離心時間為10min的改為5min，但最后所得DNA品質(zhì)及產(chǎn)量可能會有一定影響。

1．樣本采集前處理：無論田間自然生長還是實驗室組織培養(yǎng)，采摘前需避光生長24～48小時，以減少葉片組織中糖類及葉綠體含量。取適量植物細胞裂解液，加入0.5% β-巰基乙醇，10ml植物細胞裂解液加入50μLβ-巰基乙醇，混勻，形成植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，此溶液可2～8℃保存一個月。

2．葉片用蒸餾水清洗2-3次，濾紙吸干，有條件請用液氮研磨葉片1-2克，研磨完后，取800mg左右研磨的葉片粉，加入1.5ml預冷的植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，混勻。如果無條件(無液氮)，請預冷研缽，取洗過的葉片1000mg，用剪刀剪為碎塊放入玻璃勻漿器或者研缽中。加入1.5ml預冷的植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，冰上研磨至看不見明顯組織塊；

3．將研磨物放置合適的離心管，4℃，1000×g 離心5min；

4．將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，在沉淀中加入0.5ml植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，混勻，再次4℃，1000×g離心5min，取上清；合并兩次上清，將上清4℃ 1000×g再次離心5min。

5．取上清，加入一新的離心管中，4℃，16,000×g離心10min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底。

6．在線粒體沉淀中加入0.5 mL線粒體清洗液重懸線粒體沉淀，4℃，1000×g離心5min；

7．取上清，加入一新的離心管中，4℃，16,000×g離心10min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；

8．加入100μL DNA酶反應(yīng)液重懸線粒體，吹打均勻后，再加入10μL DNASE I溶液(見準備工作)，混勻，37℃水浴10min。此步為消化線粒體表面吸付的核DNA。4℃，12,000×g離心5min。盡可能的棄上清，再加入200μL TE重懸線粒體沉淀，4℃，12,000×g離心5min，洗去殘留的DNA酶。

9．得到的沉淀，用200μL TE緩沖液重懸線粒體沉淀，加入10μL RNase A。加入200μL線粒體裂解液，輕輕混勻(不可吹打)，放置1～2min，再加入150μL蛋白沉淀液，迅速混勻。4℃，12,000×g離心5min。此步驟可進一步去除核DNA。

10．取上清，加入一新的離心管中(如用于酶切分析，可加入此步：選用等體積的酚氯仿異戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提兩次，一般來說，此步可去掉一些微量蛋白及糖類，但會造成線粒體DNA的損失，因而用于PCR時可省，并不影響后續(xù)實驗)，加入0.6倍體積的異丙醇(如無異丙醇，可加入2.5倍體積的乙醇沉淀DNA，如離心管太滿可分兩管)及5～10μL 核酸核酸助沉劑，混勻，-20℃沉淀半小時左右(此步可省)，4℃，12,000×g離心10min。

11．棄上清，再加入1ml 70%乙醇清洗，4℃，12,000×g離心5min。重復用70%乙醇洗一次。

12．棄上清，再次離心1min吸棄上清，不要碰到管底，開蓋涼干約5～15min。

13．加入20-30μL TE緩沖液,輕彈管底，37℃水浴5分鐘，線粒體DNA溶解。

14．進行DNA電泳檢測及-20℃保存，進行下步的實驗。

注意事項：

1．以離心力g計算正確的離心速度，不同的離心機可據(jù)此精確計算離心速度。

2．進行Western Blot和2D-膠電泳，可直接在第7步的沉淀中加入上樣緩沖液裂解線粒體。
3．β-巰基乙醇有毒，請注意通風及防護。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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