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本試劑盒采用我公司特有的腐殖質(zhì)吸附材料，可高效專一的去除各種腐殖質(zhì)成分而絲毫不會(huì)影響DNA的產(chǎn)率，純度較酚、氯仿抽提法提高數(shù)倍。使用本試劑盒提取的DNA產(chǎn)量大、完整性好，可直接用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫(kù)構(gòu)建、Southern雜交等實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存條件：室溫(15～25℃)，有效期12個(gè)月，2～8℃保存時(shí)間更長(zhǎng)。

操作步驟：

使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

1．稱取土壤樣本0.1-0.5g，在液氮中充分研磨成細(xì)粉末，加入450μL溶液A震蕩混勻。

注：也可直接稱取樣本0.1-0.5g于離心管(建議使用2ml圓底管)，加入450μL溶液A劇烈震蕩混勻1-2min至沒(méi)有固體塊。使用液氮研磨效果最佳。

2．加入50μL溶液B充分顛倒混勻(不要?jiǎng)×艺鹗?/span>)，65℃水浴6min，每2min充分顛倒混勻一次。

3．加入100μL溶液C充分顛倒混勻(不要?jiǎng)×艺鹗?/span>)，12000rpm離心10min。

4．將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，12000rpm離心2min。

5．在吸附柱中加入200μL溶液D，將離心后的上清加入到帶有溶液D的吸附柱中，用移液器吹吸幾次混勻，12000rpm離心1min。

6．將收集管中的濾出液混勻后重新吸入吸附柱(必須)，12000rpm離心1min。

7．倒掉收集管中的廢液，在吸附柱中加入漂洗液500μL，12000rpm離心1min。

8．倒掉收集管中的廢液，重復(fù)步驟7兩次(共漂洗三次)。

9．倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管，12000rpm離心2min。

10．拿出吸附柱在室溫干燥數(shù)分鐘(因季節(jié)及氣候等因素不等)，或50℃干燥1min。

11．將吸附柱放入一個(gè)新的離心管中，加入50-100μL洗脫液(65℃預(yù)熱)，12000rpm離心1min。

12．將離心管中的液體重新加入到吸附柱中，12000rpm離心1min。離心管中即為土壤微生物DNA溶液。

13．若產(chǎn)物PCR效果差，可以適當(dāng)稀釋DNA產(chǎn)物，或添加1/10體積的PCR增強(qiáng)劑。

注意事項(xiàng)：

1．新鮮的土壤樣本會(huì)得到更高的產(chǎn)率，不同樣本在采樣前應(yīng)先查閱相應(yīng)的最佳保存條件。

2．若溶液中出現(xiàn)渾濁可在37℃水浴中溶解片刻至清澈，不會(huì)影響結(jié)果。

3．在需要吸取上清液的步驟中應(yīng)避免吸到沉淀，否則會(huì)堵塞吸附柱，并影響產(chǎn)物純度。

4．洗脫緩沖液的體積最好不少于50μL，體積過(guò)小會(huì)影響回收效率；建議使用試劑盒附帶的洗脫緩沖液，用水洗脫也會(huì)損失部分產(chǎn)物；DNA應(yīng)保存在-20℃避免反復(fù)凍融，以防降解。

5．若產(chǎn)物含有腐殖質(zhì)殘余則會(huì)嚴(yán)重影響DNA的光吸收值，應(yīng)采取電泳檢測(cè)和分光光度計(jì)檢測(cè)相結(jié)合的方式鑒定。
6．液體試劑避免接觸皮膚，若意外接觸應(yīng)立即使用大量清水沖洗。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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