產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
新型植物基因組DNA提取試劑盒	NewPurify Plant Genomic DNA Extraction Kit	50次\|200次	CS-01F99061

本試劑盒采用高效、專一結(jié)合核酸的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖系統(tǒng)，適合從各種不同的植物新鮮或凍存組織中提取基因組DNA，并可最大限度地去除植物組織中的雜質(zhì)。本試劑盒無(wú)需使用酚/氯仿抽提，操作安全。提取的基因組DNA片段大、純度高、質(zhì)量穩(wěn)定可靠，適用于PCR、熒光定量PCR、分子標(biāo)記、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。

自備試劑：無(wú)水乙醇

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)：

1、樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)導(dǎo)致提取的DNA片段較小且提取量下降。

2、第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明在Buffer LP3和Buffer GW2中加入無(wú)水乙醇。使用前請(qǐng)檢查Buffer LP1和Buffer LP2是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀，請(qǐng)將Buffer LP1和Buffer LP2于56℃水浴重新溶解。

操作步驟：

1、取植物新鮮組織100 mg左右或干重組織約20 mg，加入液氮充分研磨。

2、將研磨后的粉末收集到離心管(自備)中，加入400μl Buffer LP1和6μl RNase A(10 mg/ml)，渦旋振蕩1分鐘，室溫放置10分鐘，使其充分裂解。

注意：

1)使用渦旋振蕩或移液器吹打，充分裂解組織，組織裂解不完全會(huì)影響最終的DNA得率。

2)請(qǐng)勿在使用前將Buffer LP1與RNase A混合。

3、加入130μl Buffer LP2，混勻，渦旋震蕩1分鐘。

4、12000rpm(~～13400×g)離心5分鐘，將上清移至新的離心管(自備)中。

5、加入1.5倍體積的Buffer LP3(使用前檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，充分混勻(如500μl濾液加入750μl Buffer LP3)。

注意：加入Buffer LP3后應(yīng)立即混勻，可能會(huì)產(chǎn)生沉淀但不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6、將上步所得溶液和沉淀全部加入到已裝入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

注意：如吸附膜呈現(xiàn)綠色，向吸附柱中加入500μl無(wú)水乙醇，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

8、重復(fù)步驟7.

9、12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。

注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR 等)。

10、將吸附柱放到一個(gè)新離心管(自備)中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100μl Buffer GE或滅菌水，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

注意：

1)如果下游實(shí)驗(yàn)對(duì)pH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫。洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)，pH值低于7.0時(shí)洗脫效率不高。

2)離心之前室溫孵育5分鐘可以增加產(chǎn)量。

3)如果要提高DNA的終濃度，可以將步驟10所得的DNA洗脫液重新加至吸附膜上，重復(fù)步驟10；若洗脫體積小于100μl，可以增加DNA的終濃度，但可能會(huì)減少DNA的總產(chǎn)量。如果所得DNA的量小于1μg，推薦用50μl Buffer GE進(jìn)行洗脫。

4)因?yàn)楸４嬖谒械?/span>DNA會(huì)受到酸性水解作用的影響，如需長(zhǎng)期保存，推薦用Buffer GE洗脫并于-20℃保存。
儲(chǔ)存條件：室溫(15～30℃)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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